Sắc ký khí ghép khối phổ một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này GC/MS các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…
Hình 2. 9 Hệ thống GCMS Nguyên tắc hoạt động:
Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ đi vào trong đầu dò khối phổ. Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau (API, ESI hay APPI), sau đó các ion được ghi nhận bởi đầu dò.
2.6 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học:
2.6.1 Phương pháp đo vòng kháng khuẩn :
Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường LB đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5ml môi trường TSB lỏng và lắc qua đêm ởnhiệt độ 370C. đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200μL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường LB đặc, để khô và đục 5-6 giếng, đường kính khoảng 6mm sao cho mỗi giếng cách nhau 2-3 cm.
Kỹ thuật pha chế môi trường nuôi cấy : trong đồ án này nhằm phù hợp với điều kiện nuôi cấy 5 loài vi khuẩn kể trên, chúng ta sử dụng môi trường MHA.
Công thức : MHA 19,5g Agar 7g
Cách pha chế : Cân đúng khối lượng các thành phần đã cho, định mức lên 500 ml.
Sau đó đun sôi hòa tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,4 – 7,6. Hấp 121oC/15 phút, sau đó để nguội 45 – 50oC đổ 20ml/đĩa.
Chuẩn bị : Cắt giấy lọc có đường kính 6mm (15 đĩa), hấp ở 121ºC trong 15 phút, sấy ở 150oC trong 10 phút.
Tiến hành thí nghiệm :
Dùng pipet man hút 100μl vi khuẩn E. Coli (mật độ tế bào 106 CFU/ml), sau đó chang đều trên mặt thạch MHA đã khô ổn định, chờ khô bề mặt. Đĩa giấy 6mm vô trùng được thấm bão hòa tinh dầu nguyên chất, dung dịch 5% tinh dầu và chờ khô rồi đặt lên mặt thạch đã chang vi khuẩn, đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch. Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng, các đĩa xung quanh thấm tinh dầu nguyên chất và dung dịch 5%. Chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh (10oC) khoảng 4 – 8h để tinh dầu khuếch tán ra thạch. Sau đó đem nuôi ở 37oC trong 16 – 18giờ.
Dung dịch 5% cao chiết : cao chiết lá xoài được hòa tan trong DMSO 2%, sử dụng chất nhũ hóa là Tween 80 0,2%. Bổ sung 50μL dịch chiết thử vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 2 tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn; sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 370C trong 24 giờ. Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Ampicilin 10 g/ml, Tetracyclin 30 g/ml, Amoxilin 10 g/ml); đối chứng âm là DMSO.
Đọc kết quả Đường kính vòng vô khuẩn được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài trừ đi đường kính đĩa giấy vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức :
BK (mm) = D – d Trong đó:
D: đường kính vòng vô khuẩn (mm) d: đường kính lỗ khoan thạch (mm)
Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình.
Tiến hành xác định với các nồng độ khác nhau bằng cách pha loãng dung dịch cao.
-Ống nghiệm 1: Pha loãng 1,6g cao chiết bằng 1ml dung dịch DMSO 100%.
-Ống nghiệm 2: Pha loãng 0,5 ml từ ống 1 bằng 0,5ml dung dịch DMSO 5%.
-Ống nghiệm 3: Pha loãng 0,5 ml từ ống 2 bằng 0,5ml dung dịch DMSO 5%.
-Ông nghiệm 4: Pha loãng 0,5ml từ ống 3 bằng 0,5ml dung dịch DMSO 5%.
-Ống nghiệm 5: Kháng sinh tetracyclin pha loãng.
-Ống nghiệm 6: Kháng sinh Ampicillin pha loãng.
-Ống nghiệm 7: Dung dịch DMSO 100%.
2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hoá :
Một phương pháp đo quang phổ đã được phát triển để xác định định lượng khả
tuyến tính, độ lặp lại và độ tái lập và hệ số hấp thụ mol để định lượng một số chất chống oxy hóa. Có mối quan tâm ngày càng tăng trong việc sử dụng và đo lường các chất chống oxy hóa trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Mối quan tâm này bắt nguồn từ các bằng chứng tích lũy kết nối căng thẳng oxy hóa với nhiều phân loại.
Phương pháp thực nghiệm: đánh giá tổng năng lực chống oxy hóa bằng cách cho một lượng 0,1 ml dung dịch mẫu chứa một loại chất khử (trong ethanol) đã được kết hợp trong một ống Eppendorf với 1 ml dung dịch thuốc thử (axit sulfuric 0,6 M, natri phosphat 28 mM, và 4 m M amoni molybdate). Các ống được đậy nắp và ủ ở 95
°C trong 90 phút. Sau khi các mẫu được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, độ hấp thụ của dung dịch nước của từng mẫu được đo ở 695 nm so với mẫu trắng. Một dung dịch trắng điển hình chứa 1 ml dung dịch thuốc thử và thể tích thích hợp của cùng dung môi được sử dụng cho mẫu và được ủ trong cùng điều kiện với các mẫu còn lại.