➢ Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid
Đặc điểm: Steroid là những alcol thể rắn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, cấu trúc tổng quát vòng cyclopentanopentanoperhyrophenantren hoặc một vài trường hợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên. Steroid có nguồn gốc sinh tổng hợp như triterpen với chất liệu cơ bản là pharnesyl pyrophosphat. Sterol thuộc nhóm
steroid, phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponinsteroid. Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β –sitosterol, ergosterol, stigmasterol, …). Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester. Sterol là chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, carotene. Tan nhiều trong các dung môi không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol. Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp các ester sterol kết hợp với lipid, carotene, lecitin. Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn.
❖ Nhận biết Steroid – triterpenoid: dùng thuốc thử Liebermann – Burchard:
• Anhidrid acetic 1 ml
• H2SO4 đậm đặc
Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính.
➢ Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid
Đặc điểm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa dị vòng nitơ, có tính base, thường gặp ở nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một số loài động vật. Alkaloid tồn tại ở hai trạng thái rắn và lỏng. Đa số chúng không tan trong nước (trừ nicotin và coniine), hầu hết tan trong dung môi hữu cơ như benzen, ether, chloroform, … Các alkaloid đa số không mùi và có vị đắng, một số ít có vị cay (piperine).
Đặc biệt alkaloid có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối với hệ thống thần kinh. Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết người (như thuốc phiện, heroin), nhưng nó có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu hay thành phần quan trọng trong một số thực phẩm (như ca cao, cà phê, …).
Alkaloid có chứa lưu huỳnh thường có độc tính rất mạnh, có nhiều trong các loại nấm độc.
❖ Thuốc thử Alkaloid: dùng Thuốc thử Wagner:
- I2 1,27 g
- KI
- H2O vừa đủ 100 ml
Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch alcol, nghiên ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
➢ Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid
Đặc điểm: Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên rất nhiều màu cho rau, quả, hoa, ... Phần lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏ hay không màu. Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng.
Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và Bnối với nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6. Nếu dây C3 đóng thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ.
Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A.
❖ Thuốc thử Flavnoid:
o Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản
ứng dương tính.
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
o Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến 1 ml H2SO4 đậm đặc, đun nóng trong 1 phút.
➢ Khảo sát sự hiện diện của saponin
❖Định tính saponin trong môi trường acid, base:
- Thuốc
- Ống 1: 5 ml HCl 0,1 N (pH = 1) và 3 giọt dung dịch acol chứa mẫu thử.
- Ống 2: 5 ml NaOH 0,1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.
- Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát chiều cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm.
- Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid.
- Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid.
➢ Khảo sát sự hiện diện của Mangiferin có trong cao chiết lá xoài Theo tài liệu [1] các hợp chất có chứa Mangiferin cao có thể được định tính bằng cách: Hoà tan khoảng 0,01 g chế phẩm trong 10 ml hỗn hợp aceton - nước (1:1), thêm 0,01 g magnesi (TT) và 1 ml acid hydrocloric (TT), sau 10 phút sẽ xuất hiện màu vàng cam.
Qua đó ta có thể rút ra một vài phương pháp định tính cao chiết lá xoài:
Trong một Erlen 250ml, cho vào cao chiết thô (5 gam) và dietyl eter (30 ml), khuấy trộn đều trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lọc ngang qua giấy lọc. Lặp lại sự chiết với dietyl eter vài lần cho đến khi dung dịch chiết lần cuối không màu. Vậy sẽ có dịch chiết dietyl eter. Phần bã không tan được giữ lại để thực hiện phần tiếp theo.
Cho dịch chiết dietyl eter vào bình lóng, chiết với 3 x 20 ml dung dịch nước KOH 10%: trong bình long có hai lớp là lớp nước kiềm và lớp dietyl eter. Lấy lớp nước kiềm cho becher, trung hoà bằng dung dịch HCl 25% cho đến khi trung tính, sẽ thấy tủa. Lọc bằng phễu để lấy tủa. Hoà tủa này vào 5ml Etanol 80O và chia dung dịch này vào đều trong 5 ống nghiệm:
Ống 1: Dùng làm ống đối chứng.
Ống 2: Acid hoá với dung dịch HCl đậm đặc, sau đó cho một vài hột Mg kim loại, nếu thấy có màu đỏ, có thể là Flavonoid.
Ống 3: Phản ứng với dung dịch FeCl3, nếu có màu xanh đậm Akaloid.
Ống 4: Phản ứng FeCl3 – dung dịch HCl đậm đặc.
Ống 5: Phản ứng với dung dịch NaOH 5%, nếu thấy có màu đỏ, có thể có Antraglycosid.