CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Xác định hàm lượng tinh dầu trong gừng bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước [75].
Cân 100 g gừng nghiền nhỏ, thêm 500 ml nước cất, cho vào bình cầu 1000 ml rồi đem chưng cất tinh dầu theo phương pháp lôi cuốn hơi nước trong 90 phút, bằng bộ định lượng tinh dầu nhẹ Clevenger (d<1). Lượng tinh
dầu có trong nguyên liệu được xác định theo công thức:
𝑋𝑋= 𝑉𝑉.𝑑𝑑. 104 𝑚𝑚. (100− 𝑤𝑤) % Trong đó:
X: lượng tinh dầu trong nguyên liệu (%) m: khối lượng nguyên liệu đem chưng cất (g) d: tỷ trọng của tinh dầu
v: thể tích tinh dầu thu được (ml)
w: độ ẩm của nguyên liệu (%) Hình 2.1. Bộ chưng cất tinh dầu trong PTN
31 2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng 6-gingerol và 6-shogaol [76]
Lựa chọn điều kiện sắc ký
+ Sử dụng cột sắc ký Shim - pack GIST C18 (250 ì 4,6 mm; 5 àm)
+ Bước sóng phát hiện: 282 nm
+ Pha động: Acetonitrile: nước
+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút
+ Thể tớch tiờm: 10 àL
Xử lý mẫu [77]
Cân chính xác 0,25g bột cho vào bình nón nút mài, thêm 50ml của MeOH 75% và cân khối lượng. Dùng sóng siêu âm (100 W, tần số 40 kHz) trong 40 phút, để nguội và cân lại, bù lại thể tích dung môi đã mất. Dịch chiết được lọc qua màng 0.45 àm và chạy HPLC.
Hàm lượng 6-gingerol (6-shogaol) có trong mẫu được tính theo công thức:
X %= C⨯50⨯P m⨯102⨯(100-w) Trong đó:
- X: Hàm lượng 6-gingerol (6-shogaol) có trong mẫu phân tích (%)
- C: nồng độ 6-gingerol (6-shogaol) của dung dịch phân tích.
- m: khối lượng bột dược liệu (g)
- w: độ ẩm của bột dược liệu (%)
- P: độ tinh khiết của mẫu chất chuẩn (0,98)
Thẩm định phương pháp
+ Tính thích hợp của hệ thống
Xác định bằng cách lặp lại 6 lần một mẫu chuẩn có nồng độ chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký.
Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD không lớn hơn 2%.
+ Tính chọn lọc
32 Tính chọn lọc cho biết sự có mặt của chất phân tích có thể phân biệt được với các chất khác trong mẫu phân tích. Đánh giá tính chọn chọn bằng cách tiến hành so sánh sắc ký đồ của 3 mẫu: Mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử.
Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không được xuất hiện pic có cùng thời gian lưu với pic của 6-gingerol và 6- shogaol. Trên hình ảnh chồng phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn: Phổ tại các điểm trên 2 pic giống nhau về hình dạng và số đỉnh hấp thụ cực đại.
+ Khoảng tuyến tính của phương pháp
Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn 6- gingerol và 6- shogaol pha trong MeOH:
5, 10, 25, 50, 100, 200, 300 àg/ml từ chuẩn gốc cú nồng độ 2000 àg/ml. Tiến hành đo các mẫu dung dịch chuẩn đã chuẩn bị. Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ (trục hoành x). Tính các hệ số hồi quy a, b trong phương trình hồi quy tuyến tính (y= ax + b) và hệ số tương quan R.
Yêu cầu: 0,99 ≤ R2 ≤ 1 hay 0,995 ≤ R ≤ 1. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn △i = Ct−CcCc . 100 không vượt quá ± 15%. Riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%.
+ Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)
• Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
LOD có thể được xác định qua độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc phương trình hồi quy.
YLOD = a + k.Sy. Với độ tin cậy 95%, k = 3. Sau đó dùng phương trình hồi quy có thể tìm được LOD:
• Giới hạn định lượng được xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Dựa vào đường chuẩn:
33
LOQ = 10. Sy/b
Trong đó: b là hệ số góc trong phương trình hồi quy
Sy là độ lệch chuẩn của mẫu trắng, cũng được xác định theo phương trình hồi quy
+ Độ lặp lại
Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu. Tiến hành phân tích 1 mẫu thử 6 lần song song (bắt đầu từ giai đoạn cân mẫu). Xác định kết quả định lượng theo đường chuẩn đã xây dựng. Xác định độ lặp lại thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD giữa giá trị của các lần định lượng.
Công thức tính độ lệch chuẩn tương đối:
SD = �∑(xi-x�)2 n-1
RSD%=CV%=SD
x� ×100 Trong đó:
SD: Độ lệch chuẩn n: Số lần thí nghiệm
xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ i.
x: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm.
RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối.
CV%: Hệ số biến thiên.
Yêu cầu: Theo AOAC, các mẫu phân tích có hàm lượng chất phân tích từ 1- 10 % độ lệch chuẩn tương đối RSD không vượt quá 2,7%.
+ Độ đúng
Độ đúng đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực hoặc được chấp nhận thực. Đánh giá độ đúng thông qua độ thu hồi. Tiến hành thêm 1 lượng xác định chất chuẩn vào mẫu thực sao cho nồng độ 6-gingerol vẫn nằm trong khoảng tuyến tính. Tiến hành đo các dung dịch sau: dung dịch chuẩn, dung
34 dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn: thêm 1 lượng chính xác chất chuẩn ở các mức khác nhau lượng 6-gingerol trong mẫu thực.
Tính phần trăm thu hồi theo công thức:
R% = C(t+c)-Cm Cc ×100 Trong đó:
R%: Độ thu hồi, %
Cc: nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Ct+c: nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Ct: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Yêu cầu: Theo AOAC, mẫu phân tích có hàm lượng chất phân tích ≥ 1% độ thu hồi yêu cầu nằm trong khoảng 97 - 103 %.