a. Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn 6-gingerol và 6-shogaol có nồng độ chớnh xỏc khoảng 50 àg/ml với điều kiện sắc ký đó khảo sỏt và ghi lại cỏc giỏ trị về thời gian lưu, diện tích pic. Kết quả độ tương thích của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của thời gian lưu và diện tích pic (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống
Mẫu RT
(phút)
AREA
(mAU.s) Tailing
6 - gingerol
G1 18,653 298043 1,091
G2 18,657 297752 1,087
G3 18,654 297621 1,086
G4 18,629 297550 1,081
G5 18,561 296176 1,088
G6 18,576 294796 1,088
Xtb 18,62 296990 1,09
RSD 0,23 0,42 0,30
6- shogaol
S1 31,821 75621 1,072
S2 31,815 75646 1,068
S3 31,809 75626 1,068
S4 31,804 75384 1,066
S5 31,76 75531 1,055
S6 31,771 75517 1,062
Xtb 31,80 75554 1,07
RSD 0,08 0,13 0,56
Kết quả cho thấy giá trị RSD của thời gian lưu, diện tích pic và hệ số bất đối xứng đều đạt yêu cầu (RSD ≤ 2%) phù hợp với yêu cầu định lượng.
49 b. Tính chọn lọc
Tiến hành phân tích mẫu dung môi, mẫu thử, mẫu chuẩn, thu được kết quả sắc ký đồ các mẫu (Hình 3.3).
Dựa trên hình dạng sắc ký đồ: Phân tích các mẫu chuẩn, mẫu dược liệu và mẫu trắng trong cùng điều kiện sắc ký đã chọn. Trên sắc ký đồ các pic chuẩn tương ứng với mẫu dược liệu, đồng thời không xuất hiện trên mẫu trắng. Trên sắc ký đồ, các pic chuẩn tách xa nhau cân đối độ rộng chân pic nhỏ.
c. Xây dựng đường chuẩn
Pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ: 5; 10; 25; 50; 100; 200; 400; 500 àg/ml từ nồng độ 6-gingerol và 6-shogaol chuẩn gốc 2000 àg/ml. Tiến hành chạy sắc ký theo như điều kiện đã trình bày ở mục 3.1.1.2. Mỗi dung dịch được bơm trên hệ sắc ký 3 lần, diện tích pic trung bình thu được sẽ là số liệu để dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ.
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
uV(x10,000)
Data1:SG 50.lcd PDA Ch1 280nm,4nm
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
uV(x10,000)
Data1:BLANK.lcd PDA Ch1 282nm,4nm
0. 0 2. 5 5. 0 7. 5 10. 0 12. 5 15. 0 17. 5 20. 0 22. 5 25. 0 27. 5 30. 0 m in
-0. 1 0. 0 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 5 0. 6 0. 7 0. 8 0. 9 1. 0 1. 1 1. 2
uV(x 100, 000)
D at a1: D L1. lc d PD A C h1 280nm , 4nm
(A )
( B ) ( C )
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu thử (A), mẫu trắng (B) và mẫu chuẩn (C) Trong đó: (1) là 6-gingerol, (2) là 6-shogaol
(1)
(2)
(1)
(2)
50 Bảng 3.3. Nồng độ và diện tích pic trung bình của 6 – gingerol và 6- shogaol
Phương trình đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ các hợp chất 6- gingerol và 6-shogaol trong dung dịch và giá trị diện tích pic có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ trong khoảng khảo sát.
Độ chênh của các nồng độ 6-gingerol và 6- shogaol tính lại theo đường chuẩn đều trong khoảng ± 15%. Với hệ số hồi quy tuyến tính R2 = 0,999 thỏa mãn yêu cầu, có thể xác định hàm lượng 6-gingerol và 6- shogaol dựa vào đường chuẩn trong khoảng nồng độ 5 – 500 àg/ml đó xõy dựng. Kết quả trờn cho thấy, sự phụ thuộc của diện tớch pic vào nồng độ cú sự tuyến tớnh trong khoảng từ 5 – 500 àg/ml.
Hình 3. 4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích
y = 5213.5x + 8212 R² = 0.9998
y = 1507.7x + 946.95 R² = 0.9999
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000
0 100 200 300 400 500
6- gingerol (mAu.s) 6- shogaol (mAu.s)
STT Nồng độ àg/ml
Diện tích pic 6- gingerol (mAu.s)
Diện tích pic 6- shogaol (mAu.s)
1 5 28175 7852
2 10 55906 15529
3 25 141774 39240
4 50 269720 76461
5 100 533364 149043
6 200 1056448 304531
7 400 2064571 607599
8 500 2635105 751632
51 d. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Từ sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ, ta tính được giá trị LOD, LOQ của chất.
Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lương của 6- gingerol và 6- shogaol
Sy b
LOD (àg/ml)
LOQ (àg/ml) 6- gingerol 190,72 5217,28 0,11 0,36
6- shogaol 35,35 1506,24 0,07 0,23
Khi dùng chính chất phân tích tiến hành pha loãng liên tục trong pha động, cho chạy sắc ký tới khi nào chiều cao pic thu được vẫn còn khả năng phân biệt được với tín hiệu đường nền thì nồng độ đó được coi là giới hạn phát hiện (LOD – limit of detector). Chúng tôi tiến hành theo cách này và thu được sắc đồ như sau:
Hình 3.5. Sắc đồ của 6-gingerol ở nồng độ 0,1 àg/ml
e. Độ lặp lại.
Lấy mẫu thử bột gừng G8 tiến hành xác định độ lặp lại. Cân chính xác khoảng 0,5g mẫu bột gừng trên và xử lý theo quy trình đã xây dựng, lặp lại thí nghiệm 6 lần.
Xác định độ lặp lại theo công thức đã xây dựng trong phần 2.3.2. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5.
7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min
-0.025 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.150 0.175 0.200 0.225 0.250 0.275 0.300 0.325 mAU
282nm,4nm
18.562
30.00 30.25 30.50 30.75 31.00 31.25 31.50 31.75 32.00 32.25 32.50 32.75 min
0.675 0.700 0.725 0.750 0.775 0.800 0.825 0.850 0.875 0.900 0.925 0.950 0.975 1.000 1.025 1.050 1.075
280nm,4nm
31.830
Hình 3.6. Sắc đồ của 6-shogaol ở nồng độ 0,1 àg/ml
52 Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp
Kết quả cho thấy giá trị RSD của hàm lượng 6-gingerol và 6- shogaol trong mẫu bột gừng nhỏhơn 2,7%. Vì vậy phương pháp xây dựng có độ lặp lại tốt.
f. Độ đúng
Xác định độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn.
Để đánh giá độ đúng của phương pháp nghiên cứu, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự sai khác giữa giá trị phân tích lại và giá trị thêm chuẩn để xác định xem sự sai khác đó có ý nghĩa thống kê không.
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp
Mức thêm chuẩn
Khối lượng thử (g)
Nồng độ thêm chuẩn (àg/ml)
Nồng độ mẫu thêm chuẩn (àg/ml)
Nồng độ tìm
lại (àg/ml)
Độ thu hồi (%)
Phần trăm
(%)
6- gingerol
80%
0,5005
122,81
276,56 123,05 100,20
100,53
0,5035 278,80 125,29 102,02
0,5012 275,56 122,05 99,38
100% 0,5058
153,51 306,70 153,19 99,79
100,29
0,5078 307,91 154,40 100,58
STT Khối lượng (g)
Hàm ẩm (%)
V (ml)
Hàm lượng 6-gingerol
(%)
Hàm lượng 6-shogaol
(%)
1 1,0024
10,02
50 1,405 0,221
2 1,0024 50 1,399 0,220
3 1,0011 50 1,414 0,222
4 1,0039 50 1,392 0,223
5 1,0034 50 1,359 0,218
6 1,0062 50 1,394 0,226
Trung bình 1,394 0,222
RSD (%) 1,352 1,177
53
0,5069 307,77 154,27 100,49
120%
0,5041
184,21
339,21 185,70 100,81
100,88
0,5088 342,20 188,69 102,43
0,5029 336,60 183,09 99,39
6- shogaol
80%
0,5005
31,72
71,38 31,73 100,01
101,14
0,5035 72,09 32,44 102,24
0,5012 71,75 32,10 101,17
100%
0,5058
39,65
79,43 39,77 100,30
101,27
0,5078 80,29 40,64 102,48
0,5069 79,72 40,06 101,02
120%
0,5041
47,59
87,63 47,97 100,81
99,87
0,5088 86,80 47,15 99,08
0,5029 87,11 47,46 99,73
Với mức hàm lượng 1%, độ thu hồi R của phương pháp ở mức nồng độ này thuộc khoảng 97 – 103%. Vậy phương pháp đã xây dựng có độ đúng cao.
Kết luận: phương pháp xây dựng thỏa mãn các yêu cầu về tính thích hợp của hệ thống, tính chọn lọc, đường chuẩn, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, độ đúng.