CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
2.4 Tiến trình thực hiện
2.4.3 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất cao giàu chất cay ở quy mô phòng thí nghiệm
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất gingerol từ bã và dịch gừng sau quá trình chưng cất.
Phần bã:
+ Khảo sát dung môi chiết
+ Khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu + Khảo sát thời gian chiết
+ Tối ưu hóa quy trình theo phương pháp RSM Phần dịch:
+ Tinh chế bằng D101.
a. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất cao gừng 10% gingerol từ bã gừng khô ở quy mô phòng thí nghiệm
37 Có nhiều phương pháp để chiết xuất dầu gừng từ trước đến nay, từ các phương pháp cổ điển như chiết ngâm, ngấm kiệt, chiết hồi lưu, soxhlet cho đến gần đây là các phương pháp hiện đại ứng dụng công nghệ siêu âm, vi sóng, … Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu, đặc điểm của dược liệu và điều kiện trang thiết bị sẵn có mà sẽ lựa chọn các phương pháp chiết phù hợp. Các phương pháp hiện đại bị giới hạn khi nâng cấp quy mô do chi phí đầu tư lớn, thiết bị đắt tiền, do vậy ở quy mô công nghiệp người ta thường sử dụng 2 phương pháp chiết đó là chiết ngâm và chiết hồi lưu.
Qua tham khảo các tài liệu, cho thấy phương pháp chiết hồi lưu (thường được sử dụng để chiết xuất dược liệu) có chi phí giá thành cao, đồng thời sử dụng nhiệt độ sôi của dung môi dẫn tới có khả năng ảnh hưởng tới thành phần gingerol và shogaol. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết ngâm để tiến hành nghiên cứu. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất:
bao gồm loại dung môi, nhiệt độ chiết xuất, kích thước dược liệu, tỷ lệ dung môi/dược liệu … Khi khảo sát yếu tố nào thì thay đổi yếu tố đó còn các yếu tố khác giữ nguyên, đảm bảo sự thống nhất trong các lần thí nghiệm.
- Dung môi chiết xuất được khảo sát: nước – cồn 90 % - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35.
- Khảo sát thời gian chiết: 3h, 6h, 9h, 12h, 15h
- Tối ưu hóa quy trình chiết xuất đánh giá tác động đa yếu tố bằng mô hình phức hợp trung tâm CCD. Quy hoạch vùng khảo sát tối ưu với các nhân tố:
+ Nhân tố: Dung môi (độ cồn, %) + Nhân tố 2: Tỷ lệ DL/DM (kl/tt) + Nhân tố 3: Thời gian chiết (h)
+ Chỉ số theo dõi: hiệu suất chiết gingerol (Response) 𝐻𝐻𝑐𝑐𝑐𝑐 = 𝐾𝐾𝐾𝐾𝑐𝑐𝑐𝑐
𝐾𝐾𝐾𝐾𝐵𝐵ã 𝑔𝑔ừ𝑛𝑛𝑔𝑔. 100% (𝐶𝐶𝐶𝐶. 1) Trong đó:
Hcx là hiệu suất quá trình chiết xuất gingerol (%).
38
KLbã gừng và KLcx là khối lượng gingerol trong bã gừng và dịch chiết (g)
Số liệu thu thập từ quá trình thí nghiệm được xử lý thống kê và xây dựng mô hình bề mặt đáp ứng sử dụng chương trình Design expert 11.0 (StatEaseInc., Minneapolis, USA). Mô hình tổng quát có dạng [78]:
Trong đó: bo là hệ số chặn, bi (i = 1, 2, ..., k) là hệ số phương trình bậc 1, bij
là hệ số tương tác, bii là hệ số phương trình bậc 2 của biến Xi, Y là giá trị lý thuyết theo mô hình và e là sai số ngẫu nhiên.
Phân tích phương sai ANOVA được dùng để đánh giá mức độ phù hợp của mô hình. Từ mô hình thu được, tối ưu hóa các thông số được thực hiện với độ dao động của các biến trong khoảng mức độ [-α; +α]. Chọn lựa các phương án có mức độ mong muốn cao nhất.
Để xây dựng và đánh giá tính tương thích của mô hình đạt được, phân tích phương sai ANOVA. Một mô hình được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê khi [78]:
• Giá trị P > F của các mô hình < 0.0001.
• Độ chính xác thích hợp AP (adequate precision) được sử dụng để định hướng cho không gian thiết kế lớn hơn 4.0.
• Giá trị LOF phản ánh độ rời rạc của dữ liệu phải không có ý nghĩa về mặt thống kê.
• Giá trị R2 cao (> 0.8).
Tối ưu hóa hàm mục tiêu đã chọn bằng phương pháp hàm mong đợi, gồm ba bước thực hiện:
• Thiết lập hàm mục tiêu: Yi = fi(A1, A2,…, Ak).
• Chuyển đổi hàm mục tiêu thành hàm d: di = Ti(Yi).
• Thiết lập hàm mong đợi: D = g(d1, d2,...., dm).
39 b. Phương pháp nghiên cứu quy trình tinh chế chất cay từ dịch gừng ở quy mô PTN
Sau khi ổn định quy trình chiết xuất cao tiến hành nghiên cứu các yếu tố tác động tới quy trình tinh chế cao giàu chất cay. Nghiên cứu ảnh hưởng các yếu tố ảnh hưởng như: đường kính cột, tốc độ nạp, thể tích nạp, độ cồn hấp phụ và rửa giải đến hiệu suất tinh chế. Theo khuyến cáo từ nhà sản xuất hạt nhựa D101, tốc độ nạp dịch qua hạt thường dao động từ 2-4 BV/h (BV là thể tích hạt nhựa chiếm chỗ trên cột sắc ký) và tốc độ rửa giải từ 1-2BV/h [79]. Tuy nhiên tốc độ nạp dịch càng nhanh sẽ làm giảm thời gian nạp dịch qua cột, do vậy chọn tốc độ nạp dịch là 4BV/h và tốc độ rửa giải là 2BV/h để triển khai nghiên cứu các thí nghiệm tiếp theo.
Qua một số báo cáo đã công bố về hạt nhựa macroporous D101 đã cho thấy trong cùng 1 kích thước cột, thì chiều cao khối hạt khác nhau sẽ ảnh hưởng đến dung lượng hấp phụ và hiệu suất giải hấp phụ chất tan trên hạt [80]. Theo một số nghiên cứu về tỉ lệ chiều cao khối hạt trên đường kính cột thường nằm trong khoảng 4/1 đến 10/1. Mặt khác, trong thực tế tỉ lệ chiều cao khối hạt trên đường kính cột cần được giới hạn khi nâng cấp lên quy mô pilot do chi phí thiết kế và vận hành phức tạp. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn tỉ lệ chiều cao khối hạt trên đường kính cột là 6/1.
Các công thức đánh giá quá trình tinh chế:
- Hiệu suất hấp phụ hoạt chất trên hạt D101:
Hhp =Cpo−Cp
Cpo . 100 (1)
+ Hhp là hiệu suất quá trình hấp phụ hoạt chất (%).
+ Cpo và Cp là nồng độ hoạt chất trong dịch nạp và dịch đi qua cột (mg/ml).
- Công thức tính hàm lượng hoạt chất ở các dung môi rửa giải:
mgingerol = mp
mct. 100 (2)
+ mgingerol (%) là hàm lượng gingerol trong dung môi rửa giải.
+ mp là khối lượng gingerol trong dung môi rửa giải (mg).
40
+ mct là khối lượng chất tan trong dung môi rửa giải (mg).
- Công thức tính hiệu suất rửa giải chất tan ở các dung môi rửa giải:
Hct = mti
mto−mtc. 100 (3)
+ Ht là hiệu suất rửa giải chất tan tại thời điểm lấy mẫu (%).
+ Mti là khối lượng chất tan đi ra tại thời điểm lấy mẫu (mg)
+ mto là tổng khối lượng chất tan trong dịch nạp qua cột (mg).
+ mtc là tổng khối lượng chất tan trong dịch sau khi nạp qua cột (mg).
- Công thức tính hiệu suất rửa giải hoạt chất ở các dung môi rửa giải:
Hhc = Cpr. Vr
V. (Cpo−Cp) . 100 (4)
+ Hp là hiệu suất rửa giải hoạt chất ở các dung môi rửa giải.
+ Cpr là nồng độ hoạt chất rửa giải được ở dung môi rửa giải (mg/ml).
+ Vr là thể tích dung môi rửa giải (ml).
+ V là thể tích dịch nạp (ml).
+ Cpo và Cp là nồng độ hoạt chất trong dịch nạp và dịch ra khỏi cột (mg/ml).
- Hiệu suất toàn bộ quá trình tinh chế hoạt chất:
𝐻𝐻𝑞𝑞𝑞𝑞 =𝑚𝑚𝑝𝑝𝑝𝑝
𝑚𝑚𝑝𝑝𝑝𝑝. 100 (5)
+ H là hiệu suất toàn bộ quá trình tinh chế hoạt chất (%).
+ mpr là khối lượng hoạt chất trong phân đoạn cao giàu (mg).
+ mp0 là khối lượng hoạt chất trong dịch nạp (mg).
Kết quả được tính toàn bằng phần mềm New Microsoft Excel 2019.
Khảo sát điểm dừng của quá trình nạp dịch
Mỗi một đơn vị khối lượng hạt nhựa macroporous D101 chỉ hấp phụ được 1 khối lượng chất tan nhất định. Trong quá trình nạp dịch qua cột lượng chất tan sẽ bị hấp phụ lên trên bề mặt hạt nhựa, tuy nhiên khi càng nhiều thể tích dịch đi qua cột thì khả năng hấp phụ chất tan của hạt cũng giảm đi.
41 Dựa theo thí nghiệm khảo sát quá trình hấp phụ động trên hạt nhựa macroporous của Guangtao Jia và cộng sự, chúng tôi tiến hành thiết kế thí nghiệm đánh giá quá trình hấp phụ trên hạt nhựa macroporous D101 (hình 2.3).
Hình 2.3. Khảo sát điểm dừng của quá trình nạp dịch
- Đánh giá: chọn điểm dừng quá trình nạp dịch tại thời điểm hiệu suất hấp phụ hoạt chất trên hạt giảm mạnh lần đầu.
Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ chất cay bằng hạt nhựa macroporous D101
Khảo sát dung môi rửa giải trên cột sau giai đoạn hấp phụ
Sau giai đoạn hấp phụ, ta cần khảo sát và lựa chọn dung môi rửa tạp và dung môi giải hấp phụ hoạt chất. Qua một số khảo sát điều kiện rửa giải trên hạt nhựa macroporous, dung môi thường được sử dụng là hệ cồn – nước. Do vậy chúng tôi sẽ thực hiện thí nghiệm khảo sát rửa giải ở các độ cồn khác nhau như hình 2.4.
Dịch gừng
Cột hấp phụ Cân 13.15 g hạt đưa lên cột 1.65 cm
Tốc độ nạp dịch 1.4 ml/phút
Dịch ra Hứng phân đoạn sau
các thời điểm 40 ml
Định lượng từng phân đoạn
42 Hình 2.4. Khảo sát dung môi rửa giải
- Đánh giá: Dung môi rửa tạp được chọn là dung môi rửa ra ít hoạt chất (gingerol và shogaol) và ra nhiều chất tan.
Dung môi rửa giải hấp phụ được chọn là dung môi rửa giải ra nhiều hoạt chất và hàm lượng cao giàu hoạt chất nhất.
Khảo sát thể tích dung môi rửa tạp
‐ Khảo sát thể tích các dung môi lần lượt là nước, cồn 10% để rửa tạp và cồn 60% để rửa giải chất.
Bố trí và tiến hành thí nghiệm như hình:
Dịch gừng
Bình nón
Hấp phụ tĩnh
Hạt sau hấp phụ
Dịch lọc
Cho 200 ml dịch Thêm 5g hạt nhựa D101
Ngâm ở điều kiện tĩnh, 48 giờ, nhiệt độ phòng
Ngâm trong 85ml ở các độ cồn:
0 – 96%, 24 giờ.
Dịch nước sau ngâm
Hạt sau rửa
Đong thể tích và định lượng
43 Hình 2.5. Khảo sát thể tích dung môi rửa tạp và rửa giải
Đánh giá: điểm dừng quá trình rửa tạp, khi hiệu suất rửa tạp không đáng kể so với thời điểm trước đó.
Ổn định quy trình tinh chế ở quy mô phòng thí nghiệm
Sau khi đánh giá và lựa chọn điều kiện tinh chế, sẽ tiến hành đánh giá tính ổn định của quy trình tinh chế ở quy mô phòng thí nghiệm. Thực hiện đồng thời trên 3 cột như nhau.
Bảng 2.1. Thông số hạt và cột của thí nghiệm ổn định quy trình tinh chế ở quy mô phòng thí nghiệm
Cột Khối lượng hạt (g)
Chiều cao khối hạt (cm)
Đường kính cột (cm)
1BV (ml)
1 13.20 9.9 1.65 21
2 13.19 9.9 1.65 21
3 13.23 9.9 1.65 21
240 ml dịch gừng
Cột hấp phụ Cân 13.21 g hạt đã xử lý và đưa lên cột đường kính 1.65 cm
Tốc độ nạp 1.4 ml/min
Cột sau hấp phụ
Rửa tạp
Rửa giải
Rửa tạp lần lượt với nước, cồn 10%, tốc độ 0.7 ml/min
Rửa giải lần lượt với cồn 60%, tốc độ 0.7 ml/min
Dịch ra, Định lượng
Dịch ra, Định lượng
44 Hình 2.6. Quy trình tinh chế ở quy mô phòng thí nghiệm