2. 2. Phương pháp nghiên cứu
2. 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu chung của đề tài:
Hình 2.1: Sơ đồ mô tả các nội dung nghiên cứu của đề tài.
Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số loài vi tảo làm thức ăn đến sự sinh trưởng, tỷ lệ sống, sức sinh sản của Artemia franciscana.
Thí nghiệm 1
Xác định ảnh hưởng của một số loài vi tảo đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống, sức sinh sản và chất lượng sinh khối Artemia trong bể thí nghiệm (50L)
Thí nghiệm 2
Thử nghiệm nuôi sinh khối Artemia trong bể (4m3) bằng loài vi tảo có chất lượng tốt từ kết quả của thí nghiệm 1.
2.2.2. Chuẩn bị các điều kiện thí nghiệm:
(1) Các thiết bị nuôi sinh khối tảo và Artemia: bình nhựa, bình tam giác, túi nilon,
đá bọt, dây sục khí, thùng xốp, bể ximăng đều được ngâm chlorine nồng độ 100 - 200 ppm trong 1 ngày sau đó dùng xà phòng và nước sạch rửa lại nhiều lần.
(2) Nguồn nước: nước biển được bơm lên bể lọc thô đến bể chứa sau đó bơm qua hệ thống lọc tinh rồi được đưa đến bể để xử lý Chlorine với nồng độ 20ppm, sục khí liên tục trong 2-3 ngày sau đó trung hòa bằng Thiosulfate, lọc qua túi siêu lọc khi cấp cho hệ thống nuôi tảo và nuôi Artemia.
- Nước ót: được lấy từ ruộng muối có độ mặn 250‰, được lọc túi siêu lọc, sau đó dùng để pha độ mặn trong bể nuôi Artemia.
Pha độ mặn: Sử dụng quy tắc đường chéo
Trong đó: Va, Vb là thể tích nước ngọt và nước mặn để pha trộn.
a, b, c là độ mặn tương ứng của nước mặn, nước ngọt và nước sau khi pha trộn.
(3) Kỹ thuật chuẩn bị tảo sinh khối làm thức ăn cho Artemia :
- Cơ sở lựa chọn một số loài vi tảo cho thí nghiệm 1:
Với mục đích xác định loài vi tảo nào thích hợp nhất cho sự sinh trưởng phát triển cũng như cho chất lượng sinh khối Artemia tốt nhất thì những loài vi tảo được chọn để làm thức Artemia là phải là những loài vi tảo địa phương có khả năng thích nghi độ mặn cao (>30‰), có kích thước nhỏ (<50µm), giàu dinh dưỡng, dễ gây nuôi sinh khối.
Theo Kết quả khảo sát và phân tích thành phần loài thực vật nổi (Hoàng Thị Bích Mai, 2002) ở 39 ao nuôi tôm thuộc 4 vùng nuôi chính của tỉnh Khánh Hòa (từ năm 1998 đến đầu năm 2002) thì có 122 loài thuộc 5 ngành thực vật nổi được xác định, trong đó chiếm ưu thế nhất là ngành Heterokontophyta có 88
c a
b
(c – b)Va
loài trong đó một số loài có giá trị dinh dưỡng như: Nitzschia closterium,
Chaetoceros mulleri, Chaetoceros sp., Thallassionema sp., Skeletonema costatum, Navicula sp..Ngoài ra còn có một số loài thuộc ngành Chlorophyta thường được làm thức ăn trong sản xuất giống thủy sản như: Chlorella vulgaris, Chlorella sp1., Chlorella sp2.
Dựa vào những đặc điểm về hình thái, sinh học, thành phần sinh hóa, phân bố tôi đã chọn 3 loài vi tảo: Chaetoceros sp., Chlorella sp.,
Nannochloropsis sp để thử nghiệm nuôi sinh khối Artemia. Mặc dù có một vài nhược điểm song cả 3 loài tảo này đều có những ưu điểm như:
- Đều là những loài tảo đơn bào với kích thước nhỏ từ 2-10µm.
- Thành phần sinh hóa khá phong phú đặc biệt là hàm lượng HUFA khá cao ở hai loài tảo Chaetoceros sp. và Nannochloropsis sp..
Đồng thời để xác định Artemia sinh trưởng và phát triển tốt nhất khi cho ăn bằng tảo đơn loài hay đa loài, tôi bố trí thêm một nghiệm thức trong đó thức ăn của
Artemia hoàn toàn bằng tảo tạp được thu từ ao gây màu nuôi tảo.
- Nuôi cấy và nhân sinh khối tảo:
Tảo giống Chaetoceros sp., Chlorella sp., Nannochloropsis sp. được cung cấp bởi Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III và nhân sinh khối tại Trại thực tập. + Chuẩn bị nước và dụng cụ nuôi tảo
Nước nuôi tảo được bơm vào các túi nilon sau khi đã được xử lý và được lọc qua túi siêu lọc.
Dụng cụ sử dụng cho nuôi cấy tảo được ngâm với Chlorine ở nồng độ 30ppm trong thời gian 24 giờ, sau đó rửa sạch và lau khô để tránh nhiễm tảo tạp. Tảo rất cần dinh dưỡng cho quá trình tăng trưởng, vì vậy môi trường F2 được sử dụng trong nuôi cấy tảo.
+ Nhân giống: Tảo gốc được nhân sinh khối trong các túi nilon (30L) chứa môi trường F2 với liều lượng 1mL môi trường /1L nước nuôi tảo, được bố trí sục khí 24/24h. Sau khoảng thời gian nuôi cấy 3-6 ngày, khi tảo trong các túi nilon đạt mật độ cực đại (pha cân bằng) thì tiến hành chuyển tảo sang túi có thể
tích lớn hơn, liều lượng tảo giống ở giai đoạn này cũng chiếm khoảng 20% trong tổng số dung tích của túi tảo.
Hình 2.2: Hệ thống nuôi tảo sinh khối chuẩn bị cho thí nghiệm 1 - Đối với tảo tạp:
Tảo tạp được bố trí ở ao ương có diện tích 500m2, độ sâu 1,2m. Ao được san vét lớp bùn đáy, bón vôi diệt tạp với liều lượng 10 kg/100 m2, phơi khô đáy ao từ 5÷7 ngày.
Bơm nước biển (25‰) vào ao qua lưới lọc 120µm để ngăn chặn các loài địch hại của Artemia. Chiều cao mức nước trong ao là 0,6m.
Khi các yếu tố môi trường trong ao nuôi đạt yêu cầu, tiến hành bón phân gây màu nước với liều lượng sử dụng: Ure 20ppm, NPK 10ppm, kết hợp phân gà 40kg/100m2.
Tảo tạp được thu trực tiếp từ ao nuôi tảo sau 3-5 ngày bón phân gây màu. Khi cho Artemia ăn, nước tảo được lọc qua lưới 120µm để ngăn chặn các loài địch hại.
2.2.3 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của một số loài vi tảo làm thức ăn đến tốc độ tăng
trưởng, tỷ lệ sống, sức sinh sản và chất lượng sinh khối Artemia.
Hình 2.3: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu Ảnh hưởng của một số loài vi tảo làm thức ăn đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống, sức sinh sản và chất lượng sinh khối Artemia.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên trong 16 thùng xốp, thể tích mỗi thùng là 50L chứa 30L nước biển được lọc qua mắt lưới 120µm, độ mặn được duy trì ổn
Xác định ảnh hưởng của một số loài vi tảo làm thức ăn đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống, sức sinh sản và chất lượng sinh khối Artemia trong bể thí nghiệm
NT1: Artemia được nuôi bằng 100% tảo Chaetoceros sp. NT2: Artemia được nuôi bằng 100% tảo Chlorella sp. NT3: Artemia được nuôi bằng 100% tảo Nannochloropsis sp. NT4: Artemia được nuôi bằng tảo tạp (đối chứng) Theo dõi tốc độ tăng trưởng Theo dõi tỉ lệ sống Theo dõi sức sinh sản Đánh giá chất lượng Artemia
Thảo luận và kết luận Thu thập và xử lý số liệu
định khoảng 85‰, mật độ thả giống 100 Nauplii/L. Thời gian thí nghiệm 3 tuần, gồm 4 nghiệm thức và mỗi nghiệm thức lặp lại 4 lần, trong đó:
Nghiệm thức 1: Artemia được nuôi bằng 100% tảo Chaetoceros sp.
Nghiệm thức 2: Artemia được nuôi bằng 100% tảo Chlorella sp.
Nghiệm thức 3: Artemia được nuôi bằng 100% tảo Nannochloropsis sp. Nghiệm thức 4: Artemia được nuôi bằng tảo tạp (đối chứng)
Hình 2.4 : Bố trí thí nghiệm 1.
Thí nghiệm 2: Thử nghiệm nuôi sinh khối Artemia bằng loài vi tảo có kết quả tốt
từ thí nghiệm 1.
Hình 2.5: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu ở thí nghiệm 2
Thử nghiệm nuôi sinh khối Artemia bằng loài vi tảo có kết quả tốt từ thí nghiệm 1. Theo dõi tốc độ tăng trưởng Theo dõi tỉ lệ sống Theo dõi sức sinh sản Đánh giá chất lượng Artemia Thu thập và xử lý số liệu
Thí nghiệm được tiến hành trong bể xi măng có thể tích 4m3, mực nước trong bể 0,4 – 0,5m, mặn 85 ‰, mật độ thả giống 100 Nauplii/L, thức ăn là loài vi tảo có kết quả tốt từ thí nghiệm 1 được nhân sinh khối ở thể tích lớn (8m3) làm thức ăn cho Artemia. Thời gian thí nghiệm kéo dài 4 tuần.
Hình 2.6: Bố trí thí nghiệm 2
Chăm sóc và quản lý
- Chế độ cho ăn: 4 lần/ ngày theo kiểu thõa mãn bằng cách quan sát màu nước trong bể nuôi, biểu hiện bơi lội của Artemia, sự hiện diện thức ăn trong đường ruột Artemia ( nếu đường ruột đứt quãng thì lượng thức ăn không đủ).
- Chế độ siphon và thay nước: vào lúc 7h sáng hàng ngày, khi siphon có kết hợp với cấp nước.
- Sục khí: liên tục 24/24 để thức ăn không bị lắng tụ xuống đáy tăng hiệu quả lọc của Artemia.
2.2.4. Phương pháp xác định tỷ lệ nở, ấp trứng và thả giống:
Xác định tỷ lệ nở: Đếm ngẫu nhiên 100 trứng bào xác cho vào cốc thủy tinh
100 ml, độ mặn 30 ‰, nhiệt độ 28-300C, pH ≥ 8,0, sục khí nhẹ liên tục, ánh sáng nhẹ liên tục, thời gian ấp 24 giờ.
Kết thúc thời gian ấp tắt sục khí, đếm số Nauplii và các trứng ở giai đoạn bung dù để xác định số lượng trứng nở. Tiến hành lặp lại 5 lần đồng thời và giá trị trung bình của 5 lần lặp là tỷ lệ nở thực tế của trứng bào xác.
Xác định lượng trứng đem ấp: Dựa vào tỷ lệ nở đã được xác định, số trứng
trung bình trong 1g trứng, mật độ thả, thể tích nuôi từ đó xác định được lượng trứng cần ấp để tiến hành thí nghiệm.
Ấp trứng: Hạ độ mặn nước biển lọc sạch từ 35‰ xuống 30‰. Ngâm trứng
trong nước ngọt khoảng 60 phút, sau đó cho trứng vào bình ấp (chuẩn bị sẵn hệ thống sục khí) với mật độ 2g/lít. Duy trì ánh sáng trong quá trình ấp bằng đèn huỳnh quang. Thường xuyên kiểm tra điều chỉnh sục khí để tránh hiện tượng trứng lắng đáy cũng như trứng dính trên miệng bình ấp.
Điều kiện môi trường: pH = 8.8; t0 = 300C; S(‰) = 30; Cường độ chiếu sáng 2000 lux.
Thả giống
Trước khi thả giống kiểm tra các yếu tố môi trường, thuần hóa nhiệt độ; độ mặn của thùng xốp và xô đựng Nauplii để tránh những tác động xấu đến Nauplii. Sau 24 giờ ấp, hầu như toàn bộ trứng đã nở, tắt sục khí cho vỏ trứng nổi trên mặt nước dùng vợt vớt bỏ, sau đó tiến hành thu Nauplii và thả giống ngẫu nhiên vào các đơn vị thí nghiệm của từng nghiệm thức.
2.2.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường.
- Nhiệt độ, độ mặn, pH, NH3, oxy hòa tan (DO) của nước trong bể nuôi được theo dõi 2 lần/ngày vào lúc 7h sáng và 14h chiều.
- Các yếu tố nhiệt độ, pH, DO, độ mặn đo bằng máy đo đa yếu tố YSI của Mỹ và nhiệt kế.
Hình 2.7: Máy đo đa yếu tố YSI và nhiệt kế.
2.2.6. Phương pháp thu mẫu Artemia :
a) Phương pháp thu mẫu Artemia trong thùng xốp (50L): Thời gian thu mẫu: Lúc 8 giờ sáng.
Dụng cụ thu mẫu: Cốc thuỷ tinh 200ml có chia vạch, ca, chén, lọ dựng mẫu Cách thu mẫu: tắt sục khí trước khi thu mẫu, khuấy đều và lấy ngẫu nhiên mỗi bể 200ml nước, đếm số cá thể trong mẫu, mỗi bể lấy lặp lại 3 lần.
b) Phương pháp thu mẫu Artemia trong bể xi măng (4m3): Thời gian thu mẫu: Lúc 8 giờ sáng hàng ngày.
Dụng cụ thu mẫu: Cốc thuỷ tinh 500ml có chia vạch, xô, ca, ống nhựa PVC dài 1m với đường kính Ө = 49mm.
Vị trí thu mẫu: Do Artemia phân bố không đều nên thu mẫu tại 5 điểm trong bể nuôi (Nguyễn Văn Hòa, 2002) .
Cách thu mẫu: Tắt sục khí trước khi thu mẫu. Dùng ống nhựa khuấy tròn đều và thu mẫu bằng ống nhựa đặt vuông góc với mặt nước, đưa ống từ trên
+ + + + +
xuống sát đáy bể, dùng tay bịt chặt đầu ống phía dưới, đưa ống lên và cho vào ca nhựa đã chuẩn bị sẵn. Lặp lại tương tự ở 4 điểm còn lại.
Bảo quản mẫu bằng tuýp nhựa có chứa Formol 4 %.
2.2.7. Phương pháp kiểm tra tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống của Artemia. Phương pháp kiểm tra sự tăng trưởng:
Xác định sự sinh trưởng của Artemia 2 ngày/lần từ lúc thả giống đến 14 ngày tuổi. Thu ngẫu nhiên ở mỗi nghiệm thức 40 cá thể/lần đối với thí nghiệm 1 và 30 cá thể/ lần, cố định mẫu bằng formol 4%. Đo chiều dài mẫu từ đỉnh đầu đến cuối telson, dùng kính hiển vi có gắn trắc vi thị kính để đo chiều dài ở 3 lần thu mẫu đầu tiên. Từ 4 ngày tuổi trở đi đo kích thước bằng giấy kẻ ô ly (mm).
- Công thức quy đổi kích thước quan sát qua trắc vi thị kính:
L (mm) = 10 1 x A
L: Chiều dài thực của mẫu. A: Số vạch đọc trên kính hiển vi. δ: Bội giác của vật kính.
- Tốc độ tăng trưởng đặc trưng về chiều dài toàn thân (SGRL) được tính theo công thức:
Trong đó: SGRL: Tốc độ tăng trưởng đặc trưng về chiều dài toàn thân (% ngày).
L1: chiều dài ở thời điểm t1 (mm).
L2: chiều dài Artemia ở thời điểm t2 (mm).
Phương pháp xác định tỷ lệ sống : sau khi thu mẫu, đếm số cá thể trong
mẫu thu được và quy đổi ra tỷ lệ sống (%).
100 SGR 1 2 1 2 L x t t LnL LnL
Tỉ lệ sống (%) của Artemia được tính theo công thức (theo Nguyễn Văn Hòa, 2005):
Trong đó: TLS (%): Là tỉ lệ sống của Artemia
Xn (cá thể/L): Là số cá thể Artemia đếm được trong ngày nuôi thứ n
X1 (cá thể/L): Là số cá thể Artemia thả ban đầu.
Tỷ lệ sống (%) được tính 2ngày/lần, từ lúc thả giống đến 14 ngày tuổi.
2.2.8. Phương pháp xác định sức sinh sản:
- Thời điểm thu mẫu: Khi quan sát thấy Artemia cái trong bể mang buồng trứng căng thì tiến hành thu mẫu.
-Thời gian thu mẫu: 2 ngày/ lần và lặp lại 5 lần ở mỗi thí nghiệm.
- Cách thu mẫu: thu ngẫu nhiên 30 cá thể cái mang trứng/nghiệm thức, mổ buồng trứng để đếm số phôi nauplii của từng con cái trên kính hiển vi.
Sức sinh sản của Artemia = số phôi /con cái.
2.2.9. Đánh giá chất lượng Artemia:
Sau 21 ngày nuôi, tiến hành thu 50 gram Artemia sinh khối ở mỗi nghiệm thức, vận chuyển sống về phòng thí nghiệm và lưu giữ ở nhiệt độ -800C đến khi phân tích thành phần hóa sinh.
Chất lượng sinh khối Artemia được đánh giá thông qua phân tích hàm lượng và thành phần acid béo theo phương pháp thử Folch/GC tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Đại học Nha Trang.
2.3 Xử lý số liệu:
Sử dụng chương trình Excel để tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của các số liệu và vẽ đồ thị về sự biến thiên của chúng. Sử dụng chương trình SPSS 15.0 với ANOVA một yếu tố và phép thử Duncan để so sánh độ sai biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức P<0,05.
TLS (%) =
1
X X n
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của một số loài vi tảo làm thức ăn đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống, sức sinh sản và chất lượng sinh khối Artemia:
3.1.1 Diễn biến một số yếu tố môi trường trong quá trình tiến hành thí nghiệm:
Kết quả theo dõi diễn biến các yếu tố môi trường ở các nghiệm thức trong suốt quá trình thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 : Diễn biến một số yếu tố môi trường trong các lô thí nghiệm.
Nghiệm thức Yếu tố môi trường 1 2 3 4 Sáng 26,16±0,48 26,15±0,29 26,14±0,34 26,12±0,32 Nhiệt độ (0C) Chiều 29,33±0,69 29,57±0,54 29,49±0,62 29,49±0,62 Sáng 79,54±3,08 78.38±3,25 78,59±3,15 77,94±3,27 Độ mặn (‰) Chiều 79,06±3,17 78,06±3,17 78.26±3,34 77,83±3.14 Sáng 4,61±0,34 4,54±0,29 4,60±0,31 4,66±0,31 DO (mg/L) Chiều 4.77±0,24 4,87±0,24 4,65 ±0,24 4,72±0,27 Sáng 7,83±0,25 7,83±0,25 7,78±0,22 7,82±0,21 PH Chiều 7,91±0,18 8,01±0,14 8,12±0,17 8,07±0,16
Giá trị trình bày là trung bình ± độ lệch chuẩn.
Kết quả cho thấy: Nhiệt độ
Ở thí nghiệm này, sự chênh lệch nhiệt độ trong ngày ở các nghiệm thức không đáng kể cụ thể: nhiệt độ trung bình buổi sáng của các nghiệm thức là 26,12÷26,16oC, dao động trong khoảng từ 25,38÷26,90oC và buổi chiều là 29,33÷29,57, khoảng dao động từ 28,40÷30,50oC, nhiệt độ trung bình cả đợt nuôi là 27,80±1,73oC.
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh