L ời cảm ơn
2.4.4 Nghiên cứu sự biến đổi tuyến sinh dục cá ngạnh
- Định kỳ 1 lần/tháng thu mẫu tuyến sinh dục cá ngạnh trong các tháng nghiên cứu. - Phân tích tổ chức mô học tuyến sinh dục thông qua việc cắt lát tế bào tuyến sinh dục và phân tích đồng thời giới tính, mức độ thành thục qua các tháng nghiên cứu. - Dùng kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần để phân tích giới tính, cũng như mức độ biến đổi của tuyến sinh dục qua các tháng trong năm.
Xử lý mẫu tuyến sinh dục và phân tích tổ chức học được thực hiện theo quy trình của Phòng công nghệ tế bào động vật, Trung tâm nghiên cứu khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, bao gồm các bước sau:
(1) Định hình, vùi, cắt mẫu
- Định hình
+ Cắt mẫu có kích thước tối đa 1 cm3 (rửa qua dung dịch nước muối sinh lý nếu cần), cho vào dung dịch Bouin với thể tích lớn gấp 30 - 50 lần thể tích mẫu. Chất định hình Bouin có công thức:
750 ml dung dịch acid picric bão hòa
250 ml formalin 40%
50 ml acid axetic đậm đặc
+ Định hình mẫu trong 24 - 72 giờ, sau đó đem rửa nước. Nếu chưa có thời gian để làm các bước tiếp theo sau khi cố định thì chuyển mẫu từ dung dịch Bouin
K (%)
GW x 100 Wo
vào dung dịch Formol 10% (gọi là dung dịch đợi) để bảo quản lâu dài, tránh hiện tượng cố định quá mức.
- Rửa nước
Mẫu sau cố định (hoặc từ dung dịch đợi) được rửa dưới vòi nước chảy trong khoảng 6 giờ hoặc ngâm trong cốc nước to và cứ 15 - 20 phút thay nước một lần trong 8 - 10 giờ tùy thuộc kích thước mẫu.
- Khử nước ở mẫu cố định
Sau khi rửa nước, mẫu được chuyển qua các dung dịch cồn có nồng độ khác nhau tăng dần, từ cồn 70o rồi sang 90o - 96o - 100o1 - 100o2 mỗi lần 1 - 2giờ tùy thuộc kích thước mẫu.
- Làm trong mẫu: mẫu đã khử nước và được lần lượt chuyển vào:
Cồn - Xilen (tỷ lệ 1:1): 1 lần trong 60 phút
Xilen II: 1 lần trong 60 phút
Xilen I: 1 lần trong 60 phút
- Thấm Parafin: Chuyển mẫu lần lượt vào:
Xilen - parafin (tỷ lệ 1:1) đểở nhiệt độ 37 - 40oC
Parafin2, parafin1ở nhiệt độ từ 56 - 58oC Mỗi bước tiến hành trong 4 - 6 giờ.
Sau đó ngâm trong parafin nguyên chất có trộn thêm 5 - 10% sáp ong, để ở 58 - 60oC trong 12giờ rồi đem ra đúc (không được để nhiệt độ tăng quá 60oC vì sẽ làm mẫu quá cứng và dễ vỡ).
- Đúc Parafin
Lấy Parafin của lần thấm cuối cùng để đúc.
Chuẩn bị khuôn đúc bằng giấy sáp hoặc đĩa đồng hồ có bôi một lớp glyxerin rất mỏng (lớp glyxerin này làm parafin sau khi nguội sẽ tự bong ra khỏi đĩa).
Parafin đã nóng chảy (có thể đun nhẹ để nhiệt độ khoảng 65oC) được đổ vào khuôn đúc, chờ khi parafin hơi đục lại và dưới đáy có một lớp đã đông thì dùng panh nhỏ hơ nóng gắp mẫu đưa vào khuôn và chỉnh mẫu sao cho chiều cắt là
thẳng đứng (phải hơ nóng panh để tránh sự đông đặc nhanh và tạo bọt khí của parafin khi gặp lạnh, khi cắt mẫu dễ bị đứt).
Sau khi khối parafin đã đông đặc lại nhưng vẫn còn hơi nóng thì thả vào cốc nước lạnh để parafin được biệt hóa đồng đều, tạo độ dẻo và kết dính tốt.
Mẫu sau khi đúc để 24 giờ cho parafin ổn định thì mới cắt.
- Cắt lát mỏng
Khối parafin đã đúc được cắt thành miếng nhỏ hình thang cân sao cho mẫu nằm chính giữa khối và lớp parafin bao phủ đủ dày để mẫu không bị vỡ khi cắt.
Dùng dao mỏng hơ nóng và gắn khối parafin có mẫu lên đế cắt của máy Microtom, sửa lại khối cho đúng hình thang cân, các cạnh phải song song với nhau để khi cắt các lát mỏng sẽ nối với nhau thành băng thẳng, giúp cho việc gắn lên lam kính dễ dàng và đẹp hơn.
Chỉnh độ nghiêng của lưỡi dao khoảng 45o, kẹp đế có mẫu vào và chỉnh cho cạnh của khối song song với lưỡi dao, chỉnh để khối parafin gần sát với lưỡi dao, điều chỉnh độ dày lát cắt cho thích hợp (khoảng 7 - 12 µm).
Quay tay theo chiều kim đồng hồ để cắt mẫu thành những lát mỏng, dùng bút lông hoặc kim nhỏ để đỡ lát cắt, chuyển các lát cắt vào hộp đĩa petri có lót giấy lọc để tránh bụi khi chưa gắn ngay lên lam kính.
(2) Làm tiêu bản
- Gắn lát cắt lên lam kính
Cần phải chuẩn bị dung dịch Albumin lòng trắng trứng để làm chất gắn lát cắt chặt vào lam: lòng trắng trứng đánh kỹ, hớt bỏ bọt, chộn với glycerin tỉ lệ 1:1 rồi đem lọc, cho vào dung dịch một vài tinh thể thymol để chống nhiễm khuẩn. Dung dịch này có thể sử dụng được trong thời gian khá dài
Bôi dung dịch albumin lên lam kính, lau đầu ngón tay bằng cồn, để khô rồi dùng đầu ngón tay bôi đều albumin thật mỏng, hơ nóng khoảng 60oC trên ngọn lửa đèn cồn.
Chuẩn bị một bát nước nóng khoảng 50oC, chọn một vài lát cắt phẳng nhất và lành nhất cho vào bát nước nóng để lát cắt dãn phẳng ra. Lấy lam đã bôi
albumin nhúng vào bát nước, đồng thời vớt lát cắt ra, gắn và chỉnh cho lát cắt vào giữa lam.
Để lam đã gắn mẫu vào tủ ấm 37oC trong 12 giờ hoặc để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, tránh để bụi bám vào, sau đó mới đem xử lý loại parafin. - Loại parafin
Cho lam có mẫu vào qua xilen II, Xilen I mỗi lần 15 - 20 phút để loại bỏ parafin, rồi chuyển vào cồn - xilen tỉ lệ 1:1, cồn 100o, cồn 96o, cồn 90o, cồn 70o, nước mỗi lần 2 - 3 phút để làm no mẫu nước.
- Nhuộm Hematoxylin và Eosin
Dùng phương pháp nhuộm kép Hematoxylin và Eosin.
Nhuộm Hematoxylin trước trong vòng 15 - 20 phút, sau đó rửa dưới vòi nước chảy để làm xanh hoặc có thể biệt hóa bằng dung dịch cồn 96o và HCl tỉ lệ 99:1 trong 1 - 2 giây và rửa nước lại.
Để ráo nước, sau đó nhuộm tiếp bằng Eosin 1% trong 10 - 15 phút, rồi rửa nước.
Sau mỗi lần nhuộm nên xem dưới kính hiển vi để xác định mẫu đã bắt màu đủ chưa hay quá nhiều, nếu chưa đủ thì nhuộm thêm, nếu nhuộm quá thì với Hematoxylin biệt hóa thêm bằng cồn + acid hoặc ngâm nước cho nhạt bớt; với Eosin thì ngâm nước hoặc cồn 70o.
- Loại nước
Chuyển nhanh tiêu bản qua cồn 70o trong 1 - 2 phút, rồi qua cồn 90o, cồn 96o, cồn 1001o, cồn 1002o mỗi lần 2 - 3 phút
- Làm trong tiêu bản
Chuyển tiêu bản vào cồn - xilen tỉ lệ 1:1, xilen I, xilen II mỗi lần 2 - 3 phút
- Gắn lamen
Tiêu bản được lấy từ xilen ra để khô, nhỏ lên vị trí có mẫu 1 giọt BômCanada, từ từ hạ lamen xuống cho tiếp xúc với giọt Bom, khi giọt Bôm đã lan hết ra xung quanh, nhỏ một ít xilen lên mép lamen để dịch đẩy hết bọt khí ra.
Cho lamen vào tủ ấm 37 - 40oC trong 3 - 4 ngày để khô, rồi dán nhãn cho tiêu bản.