Kết quả định danh được thực hiện ở phòng thí nghiệm vi sinh thuộc bộ môn sinh lý, sinh hóa, vi sinh- Khoa khoa học, Đại Học Ghent, Bỉ.
Kết quả phương pháp MALDI – TOF đã phân các chủng vi sinh vật phân lập được thành nhóm chứa các chủng có khối phổ tương đồng với nhau. Kết quả phân tích khối phổ MALDI-TOF cho thấy các chủng này thuộc 7 nhóm. Trong đó, mỗi nhóm gồm các chủng có các đỉnh trong khối phổ tương đồng với nhau. (Bảng 3.2 và hình 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7)
Bảng 3.2. Phân nhóm các chủng vi sinh vật có khối phổ Maldi-Tof tương đồng
Nhóm Các chủng vi sinh vật
1 C1.1, C4.1
2 C1.2, C2, C7.2, C8.1, C8.2.1, C10.1, C11.1, C11.2, C12, C13.1, C14, C15, C17, C18.1, C18.2
3 C3.1, C3.2, C7.1, C8.2.2, C10.2, C13.2 4 C6.2, C9
5 C16.1, C16.2
6 C23, C24, C25, C26.1, C28, C31, C33, C34, C36.2, C36.3, C37 7 C30.1, C32.2
Hình 3.2. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 1
Hình 3.3. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 3
Hình 3.4. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 4
Hình 3.5. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 5
Hình 3.6. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 7
Hình 3.7. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 6
Kết quả định danh bằng phương pháp MALDI-TOF đối với các chủng này chỉ xác định được các chủng thuộc cùng một nhóm và chưa xác định được tên chi và loài cụ thể, nguyên nhân là do trong ngân hàng lưu trữ dữ liệu không có dữ liệu về các khối phổ này. Vì vậy để xác định được tên chi và loài cụ thể chúng tôi tiếp tục tiến hành định danh bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA (đối với hệ vi sinh vật hiếu khí) và giải trình tự gen pheS (đối với hệ vi sinh vật yếm khí) và so sánh đối chiếu với ngân hàng gen. Chúng tôi tiến hành lấy một chủng đại diện trong nhóm để giải trình tự gen. (bảng 3.3).
Bước đầu tiên trước khi giải trình tự gen phải tiến hành khuếch đại DNA của các chủng bằng phản ứng PCR rồi tiến hành điện di sản phẩm trên gel agarose 2%
chúng tôi thu được kết quả ở hình 3.8.
Hình 3.8. Kết quả điện di
Bảng 3.3. Kết quả trình tự gen 16S rDNA của các chủng vi sinh vật hiếu khí Nhóm Ký hiệu
chủng Trình tự gen 16S rDNA
1
C1.1 GGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAG
CACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTG GGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGC ATAAYGTCSCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGT GCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGSGACGATC CCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCA GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG ATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCA GCGGGGAGGAAGGCGTTAAGGTTAATAACCTYGKCGATTGACGTTACCCGCA GAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGC AAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAG TCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGG CTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTA GAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGAC GCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC ACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGG C4.1
AGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACT CAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCG ATGCAACGCG
2
C1.2 AGTTTGAATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAG
TCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGA GTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGG GCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTT CGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAC GGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTT CCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACSCCGCGTGAGTGATGAAGGCTT TCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCT GGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCG CGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAG GGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAT GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGA CTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGG C2
C7.2 C8.1 C8.2.1
C10.1 C11.1 C11.2 C12 C13.1
C14 C15 C17 C18.1 C18.2
GTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGT ACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCRAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACA TCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGT GGTGCATGGTTGTCGTCAKCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAA CGAGCGCAACCCTTGAT
3
C3.1 AGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGT
CGAGCGGGGGAAGGTAGCTTGCTACCGGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA TGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATCTCGAAAGGGATGCTAAT ACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATA GATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCG ACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACAC GGCCCAGACTCCTACGGGRRGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGA ACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCA CTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTCTAGTTAATACCTAGGGATAGTGGACGTTA CTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGA GGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTA TTAAGTCGGATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTG GTGAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAAT C3.2
C7.1 C8.2.2
C10.2 C13.2
GCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAATA CTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT AGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGT GGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTA AAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA ATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACTAGAAACTTTCC AGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAATCTAGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCG TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTT TTCCTTACTTGCCAGCATTTCGGATGGGAACTTTAATGATACTGCCAGTGACA ACTGGAGGAGGCGGGGACGACGTCAGTCATCAT
4
C6.2 ACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTMGGG
CCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGSTAGTAGGTGGGGTAACGG CTCACSTAGGSGRCGATCCCTAGCTGGTYTGAGAGGAWGACCARCCACACTGG AACTGAGACACGGTCCAGACTCSTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA CAATGGGCKCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCG GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTACT CATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCAC GCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTG C9
CATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGT AGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCC CTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTA GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTT GAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGG CCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG CATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCA CGGAAGTTTTCAGAGATGAGAATGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCT GCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA GCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGAC TGCCAGTGATAACTGG
5
C16.1 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGG
ACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT GGGTAACCTGCCYGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACC GGAWGCTWGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACC ACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACC AAGGCRACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTG AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCG C16.2
TAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTT GACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAG GCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATT GGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGC GGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTG GTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGAT ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCG CCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCG CAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCAT GTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCA TGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG CAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGTGACTGCCG GTGACAAACCGGAGGATGGTGGGGATGACGTCAATCATCA
Bảng 4.2. Kết quả trình tự gen pheS của các chủng vi sinh vật yếm khí Nhóm Ký hiệu
chủng Trình tự gen pheS
6 C23 GCAAGATACTTTTTATATTTCAGAAGAGATCTTGATTCGTACGCATACCT
CACCAGTACAAGCACGTACGATGGAAAAACATGACTTTTCAAAAGGTGC ACTTCGAATGATCTCACCTGGGAAAGTATTCCGTCGTGATACAGATGATG CTACTCATAGTCACCAATTCCATCAAATTGAAGGATTAGTGATCGATGAA AATATTACGATGGGTGACTTAAAAGGTACGTTAGAAGTCGTAATGAAGA AGATGTTTGGTGAAGAACGTGAAATTCGACTACGTCCTAGTTATTTCCCG TTTACTGAACCTTCTGTTGAAGTGGATGTCAGCTGTTTCAAATGTGGTGG CGCTGGCTGTAATGTCTGCAAGCACACCGGTTGGATTGAAATCTTAGGA GCCGGGATGGTTCATCCAAATGTATTGAAAATGTCAGGAATCGATCCGG AAAAATACT
C24 C25 C26.1
C28 C31 C33 C34 C36.2 C36.3 C37
7 C30.1 GCAAGATAGTTTTTATATTACAGATGAGATTTTGATGCGTACGCACACGT
CTCCAGTGCAAGCACGTACAATGGAAAAACGCCACGGTCAAGGACCAGT AAAAATTATTTGTCCTGGGAAAGTGTATCGACGAGATTCAGATGATGCT ACACATAGTCATCAATTTACACAAATTGAAGGTTTAGTAGTAGATAAAC ATATTAAAATGAGTGATTTGAAAGGAACGTTAGAGTTAGTAGCTAAAAA C32.2
ATTATTTGGGGCTGATCGTGAGATTCGATTACGACCAAGTTATTTCCCAT TCACAGAGCCATCAGTGGAAGTAGATGTCTCTTGTTTCAAATGTAAAGGT CAAGGATGTAATGTATGTAAACATACTGGATGGATTGAAATCTTAGGTG CAGGTATGGTACATCCTAATGTTCTAGAAATGGCCGGTTTTGATTCAAAT GAATATTCT
Sau khi so sánh trình tự gen của các chủng với ngân hàng Gen, kết quả 40 chủng vi sinh vật phân lập được có gen tương đồng với các loài được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả định danh của các chủng vi sinh vật phân lập từ ruột cá cơm Hệ VSV hiếu khí
STT Ký
hiệu Tên chủng STT Ký hiệu Tên chủng
1 C1.1
Klebsiella
pneumoniae subsp.
Rhinoscleromatis
15 C10.2 Acinetobacter baumannii
2 C1.2 Bacillus
antrhacis/cereus 16 C11.1 Bacillus
antrhacis/cereus
3 C2 Bacillus
antrhacis/cereus 17 C11.2 Bacillus
antrhacis/cereus
4 C3.1 Acinetobacter
baumannii 18 C12 Bacillus
antrhacis/cereus
5 C3.2 Acinetobacter
baumannii 19 C13.1 Bacillus
antrhacis/cereus
6 C4.1
Klebsiella
pneumoniae subsp.
Rhinoscleromatis
20 C13.2 Acinetobacter baumannii
7 C6.2 Escherichia coli 21 C14 Bacillus
antrhacis/cereus
8 C7.1 Acinetobacter
baumannii 22 C15 Bacillus
antrhacis/cereus
9 C7.2 Bacillus
antrhacis/cereus 23 C16.1 Brevibacterium halotoleras
10 C8.1 Bacillus
antrhacis/cereus 24 C16.2 Brevibacterium halotoleras
11 C8.2.1 Bacillus
ntrhacis/cereus 25 C17 Bacillus
antrhacis/cereus
12 C8.2.2 Acinetobacter
baumannii 26 C18.1 Bacillus
antrhacis/cereus
13 C9 Escherichia coli 27 C18.2 Bacillus
antrhacis/cereus
14 C10.1 Bacillus
antrhacis/cereus
Hệ vi sinh vật yếm khí STT Ký
hiệu Tên chủng STT Ký hiệu Tên chủng 28 C23 Enterococcus hirae 35 C32.2 Enterococcus
camelliae
29 C24 Enterococcus hirae 36 C33 Enterococcus hirae
30 C25 Enterococcus hirae 37 C34 Enterococcus hirae
31 C26.1 Enterococcus hirae 38 C36.2 Enterococcus hirae
32 C28 Enterococcus hirae 39 C36.3 Enterococcus hirae
33 C30.1 Enterococcus
camelliae 40 C37 Enterococcus
hirae 34 C31 Enterococcus hirae
Như vậy, trong số 40 chủng vi sinh vật phân lập từ ruột cá cơm, có 2 chủng thuộc loài Klebsiella pneumoniae subsp. Rhinoscleromatis (5%), 15 chủng thuộc loài Bacillus antrhacis/cereus (37,5%) và 6 chủng thuộc loài Acinetobacter baumannii (25%), 2 chủng thuộc loài Escherichia coli (5%), 2 chủng thuộc loài
Brevibacterium halotoleras(5%), 11 chủng thuộc loài Enterococcus hirae (27,5%) và 2 chủng thuộc loài Enterococcus camelliae (5%) (Bảng 1).
Ariole C.N. và Kanu N. A. (2013) cũng cho kết quả tương tự. Tác giả đã tiến hành phân lập hệ vi sinh vật từ ruột của ba loài cá (Tilapia guineensis, Sarotherodon melanotheron và Liza falcipinnis) từ ba con sông (Bonny, New Calabar và Sombriero) trong vùng nước lợ ở bờ biển Nigeria. Các chi vi khuẩn phân lập được từ ruột 3 loài cá trên được xác định chủ yếu là Aeromonas, Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Salmonella, Vibrio, Escherichia, Flavobacterium, Lactobacillus, Micrococcus và Enterobacter [15].
Kết quả này cho thấy sự đa dạng của hệ vi sinh vật trong ruột cá cơm.