Kết quả định lượng hoạt độ protease của vi sinh vậ- 123docz.net

3. Nội dung nghiên cứu

3.3.2. Kết quả định lượng hoạt độ protease của vi sinh vật trong ruột cá cơm

Tiến hành nuôi cấy 12 chủng vi sinh vật hiếu khí phân lập từ ruột cá cơm có khả năng sinh protease ngoại bào. Sau khi nuôi cấy 24 giờ ở 37oC, tiến hành xác định hoạt độ protease của dịch môi trường nuôi cấy theo phương pháp Anson cải tiến, kết quả thể hiện ở hình 3.10.

Hình 3.10. Hoạt độ protease của các chủng vi khuẩn hiếu khí

Kết quả định lượng ở hình 3.10. cho thấy số liệu phân tích định lượng phù hợp với kích thước của vòng thủy phân theo phương pháp định tính. Hầu như các chủng vi khuẩn khảo sát đều tổng hợp protease, trong đó chủng Acinetobacter baumannii C3.2 và Acinetobacter baumannii C8.2.2 có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào cao nhất giá trị đạt được lần lượt là 0,307 HP/ml và 0,312 HP/ml, hai chủng chủng sinh protease yếu nhất là Acinetobacter baumannii C7.1 (0,063 HP/ml) và Bacillus antrhacis/cereus C13.1 (0,065 HP/ml). Các chủng còn lại có hoạt độ dao động từ 0,079- 0,259 HP/ml.

Như vậy, 12 chủng vi sinh vật hiếu khí này có khả năng sinh protease, có thể tham gia vào quá trình thủy phân protein của cá trong quá trình sản xuất nước mắm.

3.3.3. Kết quả khả năng chịu muối của các chủng vi sinh vật hiếu khí

Ở nước ta hiện nay, cá cơm là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất nước mắm. Nguyên lý của quá trình sản xuất nước mắm là sự phân giải protein của cá thành các amino acid nhờ vào hệ enzyme protease ngoại bào của hệ vi sinh vật

trong ruột cá. Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất nước mắm với nồng độ muối rất cao, do đó ảnh hưởng đến khả năng sống sót và sự tồn tại của các loài vi sinh vật. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng chịu muối của 12 chủng vi sinh vật có khả năng sinh protease ngoại bào và khảo sát ở các nồng độ muối NaCl 5%, 10%, 15% tại các mốc thời gian 0 giờ, 8 giờ, 16 giờ. Từ đó xem xét khả năng tồn tại và phát triển của chúng trong điều kiện nồng độ muối tăng dần.

3.3.3.1. Khả năng chịu muối NaCl 5% của các chủng vi sinh vật hiếu khí

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng phát triển của các chủng vi

sinh vật hiếu khí qua các mốc giờ ở nồng độ 5%

STT Tên chủng Số liệu qua các mốc giờ ở nồng độ 5% NaCl 0 giờ 8 giờ 16 giờ

1 Acinetobacter baumannii C3.2 0,104ab 0,718e 1,248d

2 Klebsiella pneumoniae subsp.

Rhinoscleromatis C4.1 0,107 ab 1,250a 1,773a 3 Acinetobacter baumannii C7.1 0,108a 0,605f 1,145e 4 Bacillus antrhacis/cereus C7.2 0,107ab 0,740e 1,145e 5 Bacillus antrhacis/cereus C8.1 0,110a 0,787d 1,089ef 6 Bacillus ntrhacis/cereus C8.2.1 0,102ab 0,970b 1,506b 7 Acinetobacter baumannii C8.2.2 0,109a 0,335h 0,887i 8 Bacillus antrhacis/cereus C12 0,100b 0,815d 1,361c 9 Bacillus antrhacis/cereus C13.1 0,107ab 0,931b 1,013gh 10 Acinetobacter baumannii C13.2 0,107ab 0,786d 1,060fg 11 Bacillus antrhacis/cereus C15 0,102ab 0,860c 1,331c 12 Bacillus antrhacis/cereus C17 0,105ab 0,439g 0,963h

(Với chữ cái thường: thể hiện sự sai khác về giá trị OD giữa các chủng ở từng mốc thời gian, các chữ cái khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05)).

Kết quả thể hiện khả năng chịu muối ở 5% NaCl (bảng 3.6) cho thấy tất cả các chủng đều phát triển tốt ở nồng độ 5% NaCl. Lấy thời điểm 0 giờ để làm mốc so sánh, chúng tôi nhận thấy cứ sau một khoảng thời gian 8 giờ đem đi khảo sát thì mức độ phát triển ở từng chủng sau thời gian càng dài thì lượng vi khuẩn càng nhiều. Đem so sánh giữa các chủng ở mốc 8 giờ và 16 giờ sau khi nuôi cấy, chủng

Klebsiella pneumoniae subsp. Rhinoscleromatis C4.1 có khả năng phát triển mạnh nhất giá trị OD lúc 8 giờ đạt 1,250 và 16 giờ là 1,773, chủng Acinetobacter baumannii C8.2.2 có khả năng phát triển yếu hơn cả giá trị OD ở mốc 8 giờ và 16 giờ lần lượt là 0,335 và 0,887. Nhưng nhìn chung ở nồng độ muối NaCl 5% là điều kiện thuận lợi cho tất cả các chủng vi sinh vật này phát triển.

3.3.3.2. Khả năng chịu muối NaCl 10% của các chủng vi sinh vật hiếu khí

Sau khi khảo sát khả năng chịu muối của các chủng vi sinh vật hiếu khí ở nồng độ muối NaCl 10% ta có bảng kết quả sau:

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng phát triển của các chủng vi

sinh vật hiếu khí qua các mốc giờ ở nồng độ 10%

STT Tên chủng

Số liệu qua các mốc giờ ở nồng độ 10% NaCl

0 giờ 8 giờ 16 giờ

1 Acinetobacter baumannii C3.2 0,105abcd 0,608a 0,834a 2 Klebsiella pneumoniae subsp.

Rhinoscleromatis C4.1 0,107

abc 0,354c 0,554cd 3 Acinetobacter baumannii C7.1 0.101cd 0,150e 0,143g

4 Bacillus antrhacis/cereus C7.2 0,110a 0,194e 0,285f 5 Bacillus antrhacis/cereus C8.1 0,100d 0,166e 0,162g 6 Bacillus ntrhacis/cereus C8.2.1 0,104abcd 0,305cd 0,505d 7 Acinetobacter baumannii C8.2.2 0,108ab 0,436b 0,689b

8 Bacillus antrhacis/cereus C12 0,100d 0,630a 0,830a

9 Bacillus antrhacis/cereus C13.1 0,108ab 0,184e 0,261f

10 Acinetobacter baumannii C13.2 0,107abc 0,135e 0,236f

11 Bacillus antrhacis/cereus C15 0,102bcd 0,263d 0,373e 12 Bacillus antrhacis/cereus C17 0,106abcd 0,416b 0,617c

Ở môi trường có bổ sung 10% NaCl, ta thấy rằng mật độ tế bào của tất cả các chủng vi sinh vật có xu hướng tăng lên sau 8 giờ và 16 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên tốc độ tăng trưởng của chúng vẫn thấp hơn so với khi nuôi cấy ở môi trường chứa 5% NaCl.

Sau 8 giờ nuôi ở môi trường cơ bản có chứa 5% NaCl, chủng Acinetobacter baumannii C3.2 và Bacillus antrhacis/cereus C12 có mật độ tế bào cao nhất là OD600nm=0,608 và 0,630. Sau 16 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào của hai chủng này tiếp tục tăng lên và đạt giá trị OD600nm= 0,834và 0,830. Các chủng còn lại có mật độ tế bào dao động từ 0,143 đến 0,689 sau 16 giờ nuôi cấy.

Khi so sánh với kết quả khảo sát ở nồng độ 5% NaCl, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ muối NaCl 10% khả năng sinh trưởng và phát triển đã giảm mạnh ở hầu hết các chủng. Điều này chứng tỏ rằng nồng độ muối tăng đã ảnh hưởng đến sự phát triển của các chủng vi sinh vật này.

3.3.3.3. Khả năng chịu muối NaCl 15% của các chủng vi sinh vật hiếu khí

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng phát triển của các chủng vi

sinh vật hiếu khí qua các mốc giờ ở nồng độ 15%

STT Tên chủng

Số liệu qua các mốc giờ ở nồng độ 15% NaCl

0 giờ 8 giờ 16 giờ

1 Acinetobacter baumannii C3.2 0,105abcd 0,154a 0,111a 2 Klebsiella pneumoniae subsp.

Rhinoscleromatis C4.1 0,101

cd 0,118d 0,106ab

3 Acinetobacter baumannii C7.1 0,107abc 0,126c 0,030g

4 Bacillus antrhacis/cereusC7.2 0,102bcd 0,096f 0,083d

5 Bacillus antrhacis/cereus C8.1 0,102cd 0,083g 0,053f

6 Bacillus ntrhacis/cereus C8.2.1 0,109ab 0,139b 0,070e 7 Acinetobacter baumannii C8.2.2 0,100d 0,040h 0,021h 8 Bacillus antrhacis/cereus C12 0,106abcd 0,111de 0,098bc

9 Bacillus antrhacis/cereus C13.1 0,107abc 0,113de 0,097c

10 Acinetobacter baumannii C13.2 0,103abcd 0,117d 0,095c

11 Bacillus antrhacis/cereus C15 0,110a 0,107e 0,084d

12 Bacillus antrhacis/cereus C17 0,104abcd 0,091f 0,055f

Qua bảng 3.8 cho thấy khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã có xu hướng giảm mạnh. Sau 16 giờ nuôi cấy, chủng Acinetobacter baumannii C3.2 và Klebsiella pneumoniae subsp. Rhinoscleromatis C4.1 có mật độ tế bào cao nhất thể hiện ở giá trị lần lượt là OD600nm = 0,111 và 0,106. Các chủng còn lại thì mật độ tế bào rất thấp dao động từ OD600nm= 0,098 đến 0,021.

Sau đó, chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng chịu muối của các chủng vi sinh vật ở môi trường cơ bản có bổ sung nồng độ muối cao hơn lần lượt là NaCl 20% và NaCl 25%. Tuy nhiên ở 2 nồng độ này thì kết quả cho thấy tất cả các chủng vi sinh vật đều không có khả năng sống sót.

Tóm lại, các chủng vi sinh vật này có khả năng thích nghi và phát triển được ở các nồng độ muối NaCl 5%, 10% và 15%. Tuy nhiên, chúng phát triển mạnh nhất ở môi trường có bổ sung 5% NaCl.

Kết quả này phù hợp với kết quả đã công bố của Rudresh và cộng sự (2010). Tác giả đã khảo sát khả năng chịu muối của 19 chủng vi khuẩn được phân lập từ ruột của loài cá Garra mullya đánh bắt ở cửa sông. Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn này sinh trưởng phát triển tốt ở môi trường có bổ sung NaCl 1% và 2%, còn môi trường có bổ sung NaCl 3% chúng không có khả năng thích nghi [65].

3.4. Khảo sát một số tính chất của hệ vi sinh vật yếm khí

3.4.1. Khảo sát khả năng chịu muối

Khả năng chịu muối là một tính chất có lợi của vi khuẩn lactic. Việc khảo sát tính chất này mang nhiều ý nghĩa thực tiễn, đặc biệt là trong ứng dụng thực phẩm. Trong công nghệ thực phẩm, hầu như các sản phẩm lên men đều có sự tham gia của vi khuẩn lactic với một nồng độ muối nhất định. Ví dụ như: dưa cải muối chua có nồng độ muối là 1,8-2,25%, dưa chuột muối chua là 6-10%, nước mắm là 20-25% [32]. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng chịu muối của 13 chủng vi sinh vật yếm khí ở các nồng độ 15%, 20%, 25% ở các mốc thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và thu được kết quả như sau:

3.4.1.1. Khả năng chịu muối của các chủng vi sinh vật yếm khí ở nồng độ 15%

Bảng 3.9. Kết quả khả năng chịu muối của các chủng vi sinh vật yếm khí ở nồng độ

muối 15% (OD đo ở 600nm)

STT Tên chủng Số liệu qua các mốc giờ ở nồng độ 15% NaCl 0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ

1 E.hirae C23 0,108a 0,039de 0,046cd 0,059de 0,068fg 2 E.hirae C24 0,098bc 0.020g 0,025gh 0,034gh 0,042h 3 E.hirae C25 0,100abc 0,068a 0,036ef 0,040fg 0,082def

4 E. hirae C26.1 0,106abc 0,059b 0,043de 0,078bc 0,109c 5 E. hirae C28 0,100abc 0,026fg 0,011i 0,033gh 0,057gh 6 E. camelliae C30.1 0,102abc 0,050c 0,065b 0,081b 0,160b 7 E. hirae C31 0,098bc 0,032ef 0,018hi 0,022h 0,072efg 8 E.camelliae C32.2 0,107ab 0,036de 0,024gh 0,051ef 0,097cd 9 E. hirae C33 0,104abc 0,043cd 0,032fg 0,025gh 0,017i 10 E. hirae C34 0,102abc 0,050c 0,048cd 0,053def 0,087de

11 E. hirae C36.2 0,103abc 0,065ab 0,090a 0,107a 0,223a

12 E.hirae C36.3 0,102abc 0,039de 0,054c 0,068bcd 0,073efg

13 E.hirae C37 0,097c 0,033ef 0,046cd 0,064cde 0.078ef

Qua bảng 3.9 ta thấy tất cả các chủng vi sinh vật yếm khí đều có thể thích nghi và phát triển được ở môi trường chứa nồng độ muối NaCl 15%. Trong đó, chủng E. hirae C36.2 có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh nhất với giá trị OD đạt 0,233 ở 48 giờ. Còn chủng E. hirae C33 không có khả năng thích nghi với điều kiện này, sau 48 giờ nuôi cấy giá trị OD chỉ đạt 0,017.

Ở 0 giờ, giá trị OD của các chủng không có sự sai khác, tuy nhiên ở các mốc thời gian 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ ta thấy có sự sai khác rõ rệt giữa các chủng (các giá trị thể hiện rõ ở bảng 3.9). Ở mốc 12 giờ và 24 giờ, các chủng có giá trị OD tương đối thấp. Nguyên nhân là do các chủng chưa thích nghi được với điều kiện môi trường, tuy nhiên sau 36 giờ khi đã thích nghi được với điều kiện môi trường các chủng bắt đầu phát triển trở lại và sau 48 giờ thì OD đã tăng.

Kết quả này phù hợp với kết quả đã công bố của Saneel D., và Basappa K., (2013). Tác giả đã tiến hành khảo sát khả năng chịu muối của Lactococcus garvieae được phân lập từ sữa bò tại nồng độ 5%, 15%, 25%, kết quả thu được Lactococcus garvieae có khả năng phát triển tốt ở 5%, phát triển yếu ở 15% và không phát triển ở 25% [68].

Qua đây, nhận thấy vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá cơm có khả năng chịu muối cao hơn so với vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bò.

Karimpour F., (2013) tiến hành khảo nghiệm khả năng phát triển của L. Rhamsonus, L. Plantarum tại nồng độ muối 15% và cho thấy chúng có khả năng phát triển tại nồng độ muối này [38].

3.4.1.2. Khả năng chịu muối của các chủng ở nồng độ 20%

Sau khi khảo sát khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn lactic ở nồng độ 20% ta có bảng kết quả sau:

Bảng 3.10. Kết quả khả năng chịu muối của các chủng ở nồng độ muối 20%

(OD đo ở 600nm)

STT Tên chủng Số liệu qua các mốc giờ ở nồng độ 20% NaCl 0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ

1 E.hirae C23 0,110a 0.030cd 0,022ef 0.027e 0,047ef 2 E.hirae C24 0.097c 0,025cde 0,020ef 0,014f 0,009g 3 E.hirae C25 0,100bc 0,034c 0,023def 0,048c 0,061d 4 E. hirae C26.1 0,100bc 0,051b 0,040c 0,071b 0,096c 5 E. hirae C28 0,103abc 0,011f 0,010f 0,042cd 0,054de 6 E. camelliae C30.1 0,101abc 0,047b 0,058b 0,073b 0,128b 7 E. hirae C31 0,104abc 0,015ef 0,012ef 0,032de 0,039f 8 E.camelliae C32.2 0,099bc 0,036c 0,025de 0,035de 0,048ef 9 E. hirae C33 0,103abc 0,033c 0,022ef 0,014f 0,006g

10 E. hirae C34 0,105abc 0,020def 0,037cd 0,050c 0,054de 11 E. hirae C36.2 0,100bc 0,061a 0,082a 0,093a 0,144a 12 E.hirae C36.3 0,108ab 0,030cd 0,042c 0,081b 0,089c 13 E.hirae C37 0,107ab 0,032c 0,040c 0,072b 0,088c

Ở môi trường có nồng độ muối NaCl 20% thì sự biến đổi về quá trình thích nghi và phát triển của các chủng tương đối giống với môi trường có nồng độ muối NaCl 15%. Tuy nhiên giá trị OD đo được ở các mốc thời gian thấp hơn. Điều này cho thấy sự phát triển của các chủng ở nồng độ muối này yếu hơn so với nồng độ muối 15%.

Ở 0 giờ giá trị OD của các chủng không có sự sai khác, tuy nhiên qua 12 giờ giá trị OD thay đổi nghĩa là số tế bào sống sót thay đổi và dẫn đến sự sai khác giữa các chủng. Qua 48 giờ ủ, tất cả các chủng điều có sự sai khác rõ rệt. Qua bảng 3.10 ta cũng thấy là hầu hết các chủng đều có thể phát triển tốt ở nồng độ muối này (trừ chủng E.hirae C24 và E. hirae C33).

Nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ rằng vi khuẩn lactic có khả năng phát triển ở nồng độ 20% và thể hiện nồng độ muối càng cao thì khả năng phát triển càng thấp như Lee S.A., (2010). Khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự phát triển của vi khuẩn lactic trong sản phẩm đậu tượng dạng paste (sản phẩm truyền thống của Hàn Quốc), tác giả đã tiến hành khảo sát tại các nồng độ muối 0%, 10%, 20%, 30%, 40%. Kết quả thu được tế bào khuẩn lạc của vi khuẩn lactic giảm dần theo nồng độ muối tăng dần 10% là 26,5, 20% là 21,5 và 40% là 13 [45].

3.4.1.3. Khả năng chịu muối của các chủng ở nồng độ 25%

Sau khi khảo sát khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn lactic ở nồng độ 25% ta cũng có kết quả ở bảng sau:

Bảng 3.11. Kết quả khả năng chịu muối của các chủng ở nồng độ muối 25% (OD đo ở 600nm)

STT Tên chủng Số liệu qua các mốc giờ ở nồng độ 25% NaCl 0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ

1 E.hirae C23 0,108ab 0.038bc 0,027e 0,034de 0,041e 2 E.hirae C24 0,108ab 0,042ab 0,000h 0,000h 0,000g 3 E.hirae C25 0,110a 0,023de 0,023e 0,022f 0,042e 4 E. hirae C26.1 0,101ab 0,046ab 0,037d 0,069b 0,090b 5 E. hirae C28 0,099b 0,009f 0,009g 0,013g 0,020f 6 E.camelliae C30.1 0,102ab 0,037bc 0,050b 0,064bc 0,090b 7 E. hirae C31 0,099b 0,010f 0,000h 0,000h 0,000g 8 E.camelliae C32.2 0,104ab 0,030cd 0,018f 0,004h 0,000g 9 E. hirae C33 0,100ab 0,015ef 0,000h 0,000h 0,000g 10 E. hirae C34 0,101ab 0,013ef 0,021ef 0,035d 0,038e 11 E. hirae C36.2 0,099b 0,049a 0,071a 0,084a 0,112a 12 E.hirae C36.3 0.103ab 0,014ef 0,017f 0,027ef 0,055d 13 E.hirae C37 0,103ab 0,026d 0,045c 0,057c 0,074c

Ở môi trường chứa nồng độ muối NaCl 25% thì ta thấy một số chủng

Kết quả định lượng hoạt độ protease của vi sinh vật trong ruột cá cơm

Hệ vi khuẩn lactic trong ruột cá

Phương pháp nghiên cứu