Phương pháp nghiên cứu

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp vi sinh vật [2], [3]

2.3.1.1. Phương pháp lấy mẫu và phân lập hệ sinh vật trong ruột cá

Cá mua ở chợ về đem rửa sạch và mổ lấy ruột (nên mua cá to để dễ lấy ruột).

Nơi mổ cá, dụng cụ mổ như dao, kéo, nhíp phải được khử trùng bằng cồn. Tiến hành mổ lấy ruột cá. Chỉ lấy những phần sợi dài là ruột cá, không lấy các phần khác như mang, dạ dày, gan...

- Mẫu được nghiền nhỏ trong cối chày sứ đã vô trùng và cho vào bình tam giác. Hòa loãng mẫu được bằng nước muối sinh lý vô trùng đến 10-7, cấy trang 50àl mẫu trờn mụi trường cơ bản và mụi trường MRS rắn ở cỏc nồng độ từ 10-5 đến 10-7, ủ ở 37oC trong 24 giờ - 48 giờ.

- Cấy ria các khuẩn lạc đơn sang đĩa thạch nhiều lần để thu được dòng thuần.

Sau khi thu được dòng thuần tiến hành nhuộm gram để xác định hình thái tế bào.

2.3.1.2. Xác định hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram [2], [3], [9]

Nguyên tắc: Nhuộm Gram là một phương pháp quan trọng, nó giúp cho việc chẩn đoán, phân loại vi sinh vật. Cơ chế của phản ứng nhuộm Gram quyết định bởi khả năng bắt màu Gram của nguyên sinh chất và màng tế bào. Mức độ bền vững của sự kết hợp giữa thuốc nhuộm với nguyên sinh chất bị chi phối bởi điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy.

+ Bước một, dàn tiêu bản và cố định tiêu bản:

- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc dịch cơ thể, mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính, để khô trong phòng thí nghiệm.

- Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính. Việc cố định nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống.

+ Bước hai, nhuộm màu:

- Thứ nhất, nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước;

- Thứ hai, nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước;

- Thứ ba, khử màu: nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước;

- Thứ tư, nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô.

* Kết quả: quan sát ở vật kính dầu 100x. Vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng.

2.3.1.3. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh [3]

Cấy tế bào vi khuẩn từ ống gốc vào ống nghiệm chứa 1ml môi trường lỏng.

Nuôi cấy trong 24 giờ ở 37oC, thu dịch canh trường để thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.3.1.4. Phương pháp định danh

a. Định danh bằng phương pháp MALDI-TOF MS [27]

MALDI – TOF MS (matrix-assited laser desorption ionization and time of light mass spectrometry) là một công cụ được sử dụng để phân tích trong nhiều lĩnh vực và nó cho phép xác định trọng lượng phân tử và đặc tính cấu trúc của phân tử với tốc độ cao, dễ sử dụng, độ nhạy cao. Nó đã được công nhận bởi nhiều nhà nghiên cứu như là một phương pháp phân loại và định danh vi sinh vật [20], [26], [40], [60]. So với các phương pháp thông thường hoặc xác định dựa trên PCR, MALDI – TOF MS có các ưu điểm là thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu yêu cầu thấp và chi phí cho hóa chất ít hơn [21]. MALDI – TOF MS phân loại và định danh vi khuẩn dựa trên phát hiện các protein, peptide hoặc axit nucleic [71].

Chuẩn bị mẫu:

- Các chủng vi khuẩn lactic được bảo quản trong môi trường lỏng chứa 30%

glycerol sẽ được cấy trên môi trường rắn và ủ ở 37oC cho đến thế hệ thứ tư.

- Thu tế bào ở thế hệ thứ tư và rửa trong 300 àl mili-Q water và 900àl cồn nồng độ cao và tiến hành ly tâm ở 1300v/p trong 3 phút để thu tế bào sạch

- Tỏi huyền phự tế bào sạch thu được trong 50 àl axit formic 70% và 50 àl acetonitrile.

- Ly tâm dịch tái huyền phù ở 1300 v/p trong 3 phút ở 4oC và thu dịch nổi (dịch nổi chính là dịch chiết protein của tế bào) dùng để phân tích MALDI-TOF MS.

- Cho 1àl dịch chiết protein của tế bào vào cỏc điểm trờn đĩa MALDI.

- Sau khi dịch khụ ở nhiệt độ phũng, tiếp tục cho 1àl dung dịch gồm α- cyano-4-hydroxycinnamic axit (α-CHCA) 0,5% trong dung dịch có tỷ lệ acetonitrile:nước:trifluoroacetic axit là 50:48:2 vào đĩa và chờ khô.

- Tất cả các dịch chiết của tế bào được phân tích ít nhất hai lần.

 Phân tích MALDI – TOF MS:

Quá trình phân tích protein tế bào được thực hiện trên hệ thống máy phân tích 4800 Plus MALDI TOF/TOFTM (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA) dựa trên khả năng tích điện dương của protein. Sau khi được bắn bởi các tia laser UV Nd:YAG 200 Hz, protein bị phân hủy thành các ion và được phân tách theo tỷ lệ khối lượng phân tử và lượng điện tích dương(m/z) của phân tử protein. Kết quả của quá trình phân tích là các khối phổ protein từ 2.000 đến 20.000 Da.

Các protein chuẩn để sử dụng trong phép phân tích này là các protein hiệu chỉnh tiêu chuẩn I bao gồm insulin (m/z 5734,6), ubiquitin (m/z 8565,9), cytochrome C (m/z 12361,5) và myoglobin (m/z 16952,3) được bổ sung thêm adrenocorticotropic hormone (CTH) phân đoạn 18-39 MALDI-MS chuẩn (m/z 2465,7) (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Gemany).

Nguyên tắc MALDI-Tof-MS:

Hình 2.2. Sơ đồ thể hiện nguyên tắc hoạt động của hệ thống MALDI-TOF MS [51]

 Phân tích dữ liệu MALDI-TOF MS:

Dữ liệu thô (các phổ) được trích xuất dưới dạng tập tin từ máy phân tích 4800 Plus MALDI TOF/TOFTM. Các tập tin được nhập vào phần mềm Data Explorer 4.0 (ứng dụng hệ thống sinh học) để chuyển thành các file văn bản. Các file văn bản tiếp tục được nhập vào phần mềm BioNumerics 5.1 và được phân tích thêm. Kết quả phân tích đẻ xem xét sự tương quan giống nhau giữa các phổ.

b. Định danh bằng cách giải trình tự 16S rDNA (theo NK-BIOTEK) - Tách DNA tổng số của vi khuẩn

Cho dịch huyền phù vi khuẩn vào ống Eppendorf 1,5 ml đã có sẵn 200 μl dung dịch InstageneTM MaxTrix , vortex 10 giây và sau đó spin nhẹ, ủ ở 56oC trong 30 phút. Sau đó, vortex mẫu trong 10 giây và đun sôi ở 100oC trong 8 phút, rồi ủ trong nước đá trong 5 phút. Sau đó ly tâm ở 13.200 vòng/phút trong 5 phút, pha loãng 10 lần dịch nổi thu được để thực hiện PCR.

- PCR và giải trình tự gen 16S rDNA

Cho 5μl dịch DNA của vi khuẩn sau khi ly trích vào 20 μl hỗn hợp PCR (NK16S-PCR) và thực hiện phản ứng PCR, theo chu trình nhiệt như sau: 1 chu kỳ 95oC trong 10 phút; 40 chu kỳ gồm các giai đoạn: 94oC trong 30 giây, 60oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút và 3 chu kỳ 72oC trong 10 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1% tại 110V, 80mA, 50 phút; nhuộm bằng ethidium bromide và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bằng chương trình Gel DocTM 2000 Gel Documentation System (Bio-Rad). Marker 1kb được dùng làm thang phân tử chuẩn

DNA. Để loại bỏ muối và các tạp chất khác, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kít QiaQuick TMGel Extraction Kit (Qiagen, Germany). Sản phẩm PCR có độ dài khoảng 0,5 kb được tinh sạch và tiến hành giải trình tự trên hệ thống ABI 3130XL (Applied Biosystems, Hoa Kỳ). Trình tự DNA được so sánh với các trình tự trên Genbank bằng chương trình BLAST để tìm ra chủng vi khuẩn trong ngân hàng gen tại www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

c. Định danh bằng phương pháp giải trình tự gen PheS [4]

Phương pháp tiến hành gồm các bước:

 Tách chiết ADN:

 Rửa tế bào

 Phá vỡ tế bào

 Tinh sạch ADN

 Kết tủa ADN

 Rửa và làm khô ADN

Chất lượng độ tinh sạch ADN được kiểm tra bằng cách đo quang phổ ở bước sóng 234, 260 và 280nm (SpectraMax Plus384, Molecular Devices, California, USA) và điện di trên gel agarose 1%.

 Phản ứng PCR

Đoạn mồi PheS-21-F và PheS-22-R được dùng để nhân lên đoạn gen PheS.

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy GeneAmp PCR 9600 thermocyler bao gồm các bước:

- Biến tính ADN

- Bắt cặp mồi vào sợi khuôn - Phản ứng kéo dài chuỗi.

Ba bước trên hình thành một chu kỳ và phản ứng PCR được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ.

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%.

Sau khi kiểm tra, nếu sản phẩm PCR có kích thước đúng như kích thước của đoạn gen PheS thì chúng sẽ được tinh sạch bằng hệ thống màng lọc Nucleofast 96 PCR. Để giải trình tự gen PheS thì sản phẩm PCR vừa tinh sạch ở trên sẽ được chạy

PCR lần thứ hai, sử dụng mồi xuôi và mồi ngược tách biệt. Sau đó, sản phẩm PCR của mồi xuôi và sản phẩm PCR của mồi ngược được đưa đi giải trình bằng máy ABI PRISM 3100.

 Phân tích trình tự gen pheS và xác định loài

Số liệu trình tự thô được chuyển đến phần mềm AutoAssemble 1.40 hoặc GeneBuilder, trình tự liên tục của gen PheS được xác định. Trình tự liên tục này sẽ được nhập vào chương trình Bionumeric 5.1, giá trị tương đồng của các loài và cây phân loại được tạo ra dựa vào phương pháp neighbourjoining và maximum- parsimony. Trình tự của chủng này được so sánh với các loài trong ngân hàng gen BCCM/LMG của trường Đại Học Gent (Gent, Bỉ) hoặc Ngân hàng trình tự nucleotit quốc tế (EMBL). Sử dụng chương trình FASTA để xác định loài có mối quan hệ gần nhất đã biết của trình tự trong phần gen pheS.

2.3.1.5. Phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme [3], [8]

Phân phối 200μl dịch cấy tăng sinh vào bình tam giác dung tích 100ml có chứa 20ml môi trường dinh dưỡng (1% peptone, 0,3% cao thịt, 0,5% NaCl). Quá trình nuôi cấy được thực hiện trên máy lắc 200vòng/phút trong 24 giờ ở 37oC. Kết thúc thời gian nuôi cấy, canh trường chứa enzyme được ly tâm tách sinh khối tế bào 14.000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong 10 phút. Sau ly tâm thu dịch nổi tiến hành xác định hoạt độ amyalase và protease.

2.3.2. Phương pháp khảo sát khả năng sinh protease 2.3.2.1. Thử hoạt độ protease bằng phương pháp định tính

Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch thể hiện bằng vòng thuỷ phân casein.

Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng protease ngoại bào do đó có thể phân giải casein thành amino acid. Chung quanh khuẩn lạc của các vi khuẩn khi cấy trên môi trường casein sẽ hình thành các vòng phân giải trong suốt.

Tiến hành cấy trang các chủng vi sinh vật lên đĩa thạch có chứa 1% pepton, 0,3% cao thịt, 0,5% glucose, 0,5 NaCl, 2% agar, 0,2% casein. Sau đó cho vào tủ ấm nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Tiến hành nhuộm bởi Comassie Blue. Comassie Blue chỉ bắt màu protein mà không bắt màu các amino acid hay các peptide mạch ngắn.

Nếu vi khuẩn có khả năng sinh protease ngoại bào thì enzyme này sẽ thủy phân

casein có trong thành phần môi trường thành các amino acid hoặc các peptide mạch ngắn. Khi nhuộm bởi Comassie Blue trên đĩa thạch sẽ xuất hiện màu xanh của thuốc nhuộm, còn những chỗ casein đã bị thủy phân sẽ có màu trong suốt. Dựa vào hình ảnh quan sát được ta có thể biết khả năng sinh protease của chủng vi khuẩn đó.

2.3.2.2. Thử hoạt độ protease bằng phương pháp định lượng

Xác định hoạt độ của protease theo phương pháp Anson cải tiến [11], [12].

- Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa vào sự thuỷ phân casein bởi protease. Sau đó bất hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng acid tricloacetic (TCA). Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, kết quả phân tích dựa vào đường chuẩn tyrosin.

Đơn vị hoạt độ protease (HP) là lượng enzyme trong một phút ở 30oC chuyển hoá được một lượng casein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong TCA cho phản ứng màu với thuụ́c thử Folin tương đương với 1àmol tyrosin.

- Tiến hành:

Thực hiện phản ứng thuỷ phân: chuẩn bị 2 eppendorf sạch trong đó 1 eppendorf kiểm tra và 1 eppendorf thí nghiệm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để hạn chế sai số. Trước khi tiến hành phản ứng thuỷ phân thì dung dịch cơ chất là casein và dung dịch enzyme đều phải được ủ ở nhiệt độ 37oC.

Đối với ống thí nghiệm:

+ Cho vào mỗi ụ́ng 350àl dung dịch casein ở 37oC.

+ Tiếp tục cho thờm 175àl dung dịch enzyme ở 37oC vào ụ́ng đó cú casein vàgiữ ở 35oC trong thời gian 10 phút để phản ứng thuỷ phân xảy ra.

+ Kết thỳc phản ứng bằng cỏch cho 875àl dung dịch axit tricloacetic 5% vào để bất hoạt enzyme và kết tủa cơ chất không được thuỷ phân, lắc đều.

+ Để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 15 phút.

+ Lọc tách kết tủa và thu dung dịch trong suốt. Dung dịch thu được dùng để làm phản ứng màu với thuốc thử Folin.

Đối với ống kiểm tra:

+ Cho 175àl dung dịch enzyme ở 37oC vào ụ́ng.

+ Cho 875àl dung dịch tricloacetic 5% vào, lắc đều để bất hoạt enzyme.

+ Tiếp tục cho vào ụ́ng 350àl dung dịch cazein ở 37oC giữ trong thời gian 10 phỳt.

+ Lọc thu dịch trong để làm phản ứng màu với thuốc thử Folin.

Phản ứng tạo màu:

+ Cho 0,5ml dịch lọc vào ống nghiệm + Tiếp tục cho 2ml Na2CO3 6%, lắc đều.

+ Cho thêm 0,5ml thuốc thử Folin 0,2N lắc đều.

+ Giữ 30 phút ở nhiệt độ phòng.

+ So màu trên máy quang phổ bước sóng 750nm - Tính kết quả.

Lấy số liệu đọc trên máy của 2 mẫu thí nghiệm và 1 mẫu kiểm tra sau đó tính:

ΔOD= ODTN - ODKT

Dựa vào phương trình đường chuẩn tyrosin (mục 2, phụ lục) để tính lượng àmol tyrosin tương ứng.

Tính số đơn vị hoạt động proteolitic của 1ml dung dịch enzyme theo công thức:

HP/ml = (àmol tyrosine  8)/t Trong đó: HP/ml: hoạt độ chung

8: tổng tỷ lệ thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng (1 enzyme: 2 casein: 5 TCA) t: thời gian để enzyme tác dụng với cơ chất (10 phút)

2.3.3. Khảo sát khả năng chịu muối NaCl

Khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn được đánh giá qua giá trị OD600nm

sau khi nuôi chúng trong môi trường cơ bản có chứa nồng độ muối NaCl tương ứng 5%, 10%, 15% qua các mốc thời gian 8 giờ và 16 giờ (đối với hệ vi sinh vật hiếu khí) và nuôi trong môi trường MRS lỏng có chứa các nồng độ muối tương ứng là 15%, 20%, 25% qua các mốc giờ là 0 giờ, 12 giờ , 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ (đối với hệ vi sinh vật yếm khí).

Cách tiến hành: Theo phương pháp của Mendpara J. và các cộng sự (2013) [52], được tiến hành như sau:

- Nuôi chủng trong fancol 50ml với thể tích môi trường là 25ml trong 24 giờ ở 37˚C.

- Ly tâm 4000 vòng/phút ở 4˚C trong 20 phút nhằm mục đích thu sinh khối.

- Loại bỏ môi trường và rữa sinh khối bằng nước muối sinh lý trong hai lần.

- Tỏi huyền phự trong nước muụ́i sinh lý bằng vortex và phõn phụ́i 1000àl vào ependoff .

- Đo OD600nm để đạt OD ~1.

- Phõn phụ́i mỗi ependoff chứa 1000àl huyền phự vào 10 ependoff chứa 900 àl mụi trường bổ sung cỏc nồng độ muụ́i NaCl tương ứng.

- Đo OD600nm tại 0 giờ.

- Ủ mẫu trong tủ ấm ở 37˚C và đo OD600nm sau các mốc thời gian cần khảo sát.

- Thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp để hạn chế sai số.

Tính kết quả:

Giá trị đọc được trên máy quang phổ chính là:

OD = ODTN – ODĐC

Phân tích kết quả dựa trên sự so sánh giá trị ở các mốc thời gian sau so với mốc thời gian trước để đưa ra kết luận khả năng tồn tại và phát triển của các chủng ở các nồng độ muối khác nhau.

2.3.4. Khảo sát khả năng chịu axit [44]

Khả năng chịu pH thấp của các chủng khảo sát được đánh giá qua lượng vi khuẩn sống sót sau khi ủ ở pH 2 qua các mốc thời gian 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ. Số tế bào vi khuẩn sống sót được xác định theo phương pháp Kock.

Tiến hành: Chủng được nuôi cấy trong 24 giờ, ly tâm thu sinh khối ở 5000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, rửa sinh khối bằng đệm phosphate 0,1M pH 7,2 hai lần, sau đó tái huyền phù trong 1ml đệm bằng vortex, trộn 1ml dịch sau khi tái huyền phù với 24,5 ml dung dịch NaCl 0,2%, pH = 2 (pH được chỉnh bằng dịch HCl 5M)

Mẫu được lấy theo cỏc mụ́c thời gian 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ. Lấy 50 àl huyền phù vi khuẩn có độ pha loãng thích hợp được cho vào đĩa petri vô trùng. Sau đó, đổ một lớp môi trường MRS agar nhiệt độ 43oC lên và xoay đĩa để phân tán đều tế bào vi khuẩn. Lớp MRS agar 43oC thứ hai tiếp tục được đổ khi lớp thứ nhất vừa đông. Chờ cho lớp thứ hai đông và ủ đĩa vào tủ ấm ở 37oC trong 48 giờ. Số khuẩn

lạc xuất hiện sau khi ủ được ghi nhận. Kết quả số tế bào sống sót (log CFU/ml) được tính theo công thức:

Log CFU/ml = log (Ai . Di / V) Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình trên một đĩa Di là độ pha loãng

V là dung tớch huyền phự cho vào mỗi đĩa (50àl).

2.3.5. Khảo sát khả năng tự kết dính

Nguyên tắc: Khi các tế bào vi khuẩn tự kết dính lại với nhau thì sẽ tạo nên những hạt có kích thước lớn hơn và lắng xuống trong dung dịch. Do đó theo thời gian mật độ tế bào ở bề mặt dịch vi khuẩn sẽ giảm đi. Mức giảm của OD phản ánh tỷ lệ vi khuẩn đã kết dính.

Tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành phương pháp của Kos và cộng sự (2003) [43] gồm các bước sau:

- Nuôi cấy chủng trong môi trường MRS qua 24 giờ ở 37oC không lắc.

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, ở nhiệt độ phòng để thu sinh khối.

- Rửa sinh khối bằng đệm PBS (pH 7,2) 2 lần.

- Tái huyền phù trong đệm PBS sao cho OD600nm = 1.

- Phân phối 6ml huyền phù (OD600nm = 1) vào ống nghiệm, vortex 10 giây để trộn đều dịch.

- Lấy 1ml huyền phù ở mỗi ống nghiệm đo OD mẫu 0 giờ.

- Ủ yên tĩnh các ống nghiệm có chứa huyền phù (OD600nm = 1) ở 37oC trong 5 giờ để tạo điều kiện cho các vi khuẩn lactic tự kết dính và lắng xuống.

- Đo OD 600nm của dịch bề mặt ở mỗi ống nghiệm.

- Tỷ lệ tự kết dính (%) được tính bằng công thức:

) (

A0

1 At  100

Trong đó: At: Độ hấp thụ tại thời điểm 5 giờ.

A0: Độ hấp thụ tại thời điểm 0 giờ.