3. Nội dung nghiên cứu
3.4.4. Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi sinh vật yếm khí
Khả năng sinh bacteriocin là một tính chất quan trọng và có ý nghĩa trong y học của vi khuẩn lactic. Bacteriocin là chất được vi khuẩn lactic sản xuất ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Nó có khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh. Những loài vi khuẩn gây bệnh điển hình tồn tại trong thực phẩm và gây bệnh cho con người như Samonella và E. coli. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic bằng cách dùng hai loài vi khuẩn gây bệnh trên để làm vi khuẩn chỉ thị.
Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn của 13 chủng vi khuẩn lactic thể hiện hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch cho thấy xuất hiện các vòng sáng vô khuẩn với đường kính khác nhau.
Bảng 3.13. Khả năng kháng E. coli và Samonella của các chủng vi khuẩn lactic
STT Tên chủng Đường kính vòng kháng khuẩn
E. coli Samonella 1 E.hirae C23 - - 2 E.hirae C24 ++ ++ 3 E.hirae C25 + ++ 4 E. hirae C26.1 ++ +++ 5 E. hirae C28 ++ +++ 6 E.camelliae C30.1 - ++ 7 E. hirae C31 + + 8 E.camelliae C32.2 ++ - 9 E. hirae C33 +++ +++ 10 E. hirae C34 + + 11 E. hirae C36.2 - - 12 E.hirae C36.3 + ++ 13 E.hirae C37 - -
+++: Đường kính vòng vô khuẩn 10-15cm ++: Đường kính vòng vô khuẩn 5-10cm
+: Đường kính vòng vô khuẩn <5cm
Đối với chủng kiểm định là Escherichia coli (bảng 3.12), chủng E.hirae C33 có tính kháng khuẩn lớn hơn 10mm nên thể hiện tính kháng mạnh hơn những chủng còn lại. Bên cạnh đó có 4 chủng là E.hirae C24, E.hirae C26.1, E.hirae C28, và
E.camelliae C32.2 đã cho vòng vô khuẩn nằm trong khoảng 5 – 10mm, biểu hiện tính kháng khuẩn ở mức trung bình. 8 chủng E.hirae C25, E.camelliae C30.1, E. hirae C31, E.hirae C34, E. hirae C36.2, E.hirae C36.3 và E.hirae C37 tính kháng khuẩn kém hoặc không có khả năng kháng lại chủng kiểm định được sử dụng.
Đối với chủng kiểm định là Samonella typhimurium (bảng 3.12), chủng phân lập có biểu hiện tính kháng khuẩn mạnh hơn so với chủng kiểm định là Escherichia
coli. Tiêu biểu các chủng E.hirae C26.1, E.hirae C28 và E.hirae C33 có đường kính vòng sáng lớn hơn 10mm, do đó thể hiện tính kháng mạnh nhất.
Theo nhiều kết quả nghiên cứu của các tác giả như Wakil S.M và Osamwonyi U.O (2012), V.Sumathi và D.Reetha (2012), Galal Al Askari và cộng sự (2012), Bello (2013), Lelise A (2014) cho thấy kết quả nghiên cứu trên là hợp lý.
Thirabunyanon và cộng sự (2008) đã khảo sát khả năng sinh bacteriocin của 40 chủng phân lập từ sữa lên men và thấy có 5 chủng RM11, RM24, RM25, RM28, RM34 trong số các chủng có thể ức chế 8 tác nhân gây bệnh qua thực phẩm đó là
Helicobacter pylori, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes và Vibrio cholerae
với đường kính vòng kháng khuẩn từ 11-19mm. Trong đó RM11 và RM28 có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất, vòng kháng khuẩn rất rộng như RM11 có vòng kháng
Salmonella typhimurium đường kính 16mm, vòng kháng Staphylococcus aureus đường kính 18mm, RM28 có vòng kháng Salmonella typhimurium đường kính 19mm [73].
Osamwonyi U.O và Wakil S.M (2012) đã khảo sát khả năng kháng E.coli và
Samonella spp của các chủng thuộc Lactobacillus, kết quả thu được cho thấy,
Lactobacillus brevis kháng E.coli với đường kính vòng kháng khuẩn là 10±0,1(mm), kháng Samonella spp là 5 ±0,1(mm), Lactobacillus plantarum kháng
Samonella.spp với kích thước vòng kháng khuẩn là 10±0,1 (mm) [58].
Askari G.A., và cộng sự (2012) đã khảo sát khả năng kháng E.coli và
Samonella. spp và thu được kết quả như sau: Lactobacillus brevis và Lactobaci-llus plantarum không có khả năng kháng Samonella spp nhưng có khả năng kháng
E.coli với đường kính vòng kháng khuẩn tương ứng là: 8 (mm), 9 (mm) [16]. Qua đây, nhận thấy các chủng vi khuẩn lactic thuộc loài Enterococcus hirae sinh bacteriocin có hoạt tính mạnh hơn so với hai loài Lactobacillus brevis và
Lactobacillus plantarum.
Yusra, Fauzan Azima và cộng sự (2013) đã tiến hành khảo sát khả năng sinh bacteriocin của 138 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ Budu (một sản phẩm cá lên men truyền thống chế biến từ cá thu Tây Ban Nha được sản xuất ở Tây Sumatra).
Kết quả cho thấy có 8 chủng (B2, B4, B5, B9, B11, B13, B28 và B34) có khả năng ức chế cao nhất các tác nhân gây bệnh Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella thypi và Listeria monocytogenes với vòng kháng khuẩn rất rộng đường kính từ 10-24mm. Chủng B4 có vòng kháng Escherichia coli đường kính 20mm, Staphylococcus aureus 24mm, Listeria monocytogenes 18mm, chủng B28 có vòng kháng Escherichia coli 13mm, Staphylococcus aureus 18mm, Salmonella thypi
15mmvà Listeria monocytogenes 19mm [77].
Nwafor O.E., (2014) đã khảo sát khả năng kháng E.coli và Samonella typhi
của các loài vi khuẩn lactic là L.acidophilus, L.lactic, L.bugaricus, L.casei,
Leuconotoc sp, S.thermophiles, S.cremoris, S.pyogenes. Đường kính vòng kháng khuẩn kháng E.coli dao động từ 3±0,05 (mm) đến 6±0,25 (mm), đường kính vòng kháng khuẩn kháng Samonella typhi dao động từ 4±0,2 (mm) tới 10±0,02 (mm) [57]. Mongkol và cộng sự (2009) đã tiến hành khảo sát khả năng sinh bactericin của 5 chủng phân lập từ sữa lên men. Năm trong số các chủng (RM11, RM24, RM 25, RM28, RM34) ức chế sự tăng trưởng của cả 8 tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm như
Helicobacter pylori, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae. Trong đó chủng RM11 và RM28 ức chế các vi khuẩn gây bệnh tốt hơn các chủng khác [54].
Việc sinh ra bacteriocin của vi khuẩn lactic để ức chế hay tiêu diệt các chủng vi khuẩn gây bệnh là một tính chất quan trọng để tuyển chọn chủng có tiềm năng probiotic. Qua việc khảo sát khả năng sinh bacteriocin của 13 chủng vi sinh vật yếm khí ta thấy chủng E. hirae C33 và E. hirae C26.1 có đủ điều kiện probiotic về phương diện này.
Hình 3.13. Vòng kháng khuẩn từ bacteriocin của các chủng vi sinh vật yếm khí
a: kháng khuẩn yếu, b: kháng khuẩn trung bình, c: kháng khuẩn mạnh
PHẦN 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Từ các mẫu ruột cá cơm đã phân lập được 40 chủng vi sinh vật. Trong đó, có 27 chủng vi sinh vật hiếu khí và 13 chủng vi sinh vật yếm khí. Tất cả các chủng này đã được định danh đến cấp độ loài, chủ yếu là các chủng thuộc loài Klebsiella pneumoniae subsp. Rhinoscleromatis, Bacillus antrhacis/cereus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli và Brevibacterium halotoleras (đối với hệ vi sinh vật hiếu khí) và các chủng vi khuẩn lactic Enterococcus hirae và Enterococcus camelliae (đối với hệ vi sinh vật yếm khí).
Đã khảo sát được một số tính chất của hệ vi sinh vật hiếu khí: khả năng sinh protease ngoại bào và khả năng chịu muối NaCl ở các nồng độ 5%, 10% và 15% của các chủng vi sinh vật hiếu khí phân lập được từ ruột cá cơm. Trong đó có 12 chủng sinh protease ngoại bào và có khả năng thích nghi và phát triển tốt nhất ở nồng độ muối NaCl 5%.
Đã khảo sát được một số tính chất của hệ vi sinh vật yếm khí: khả năng chịu muối NaCl ở các nồng độ 15%, 20% và 25%, khả năng chịu axit, khả năng tự kết dính và khả năng sinh bacteriocin.
4.2. Kiến nghị
Do thời gian tiến hành nghiên cứu và điều kiện vật chất có giới hạn nên đề tài vẫn còn có những hạn chế chưa thực hiện, vì vậy chúng tôi xin đề nghị một số vấn đề sau:
Tiếp tục khảo sát một số ảnh hưởng của thành phần, nhiệt độ và pH của môi trường nuôi cấy, tạo điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzyme của các chủng vi sinh vật hiếu khí phân lập từ ruột cá nục.
Tiếp tục khảo sát các tính chất probiotic khác như khả năng kháng kháng sinh, giảm hấp thu cholesterol của các chủng vi sinh vật yếm khí. Đồng thời, khảo sát các điều kiện tối ưu cho sự phát triển của các chủng vi sinh vật này.
Nghiên cứu tinh sạch chế phẩm sinh học này để ứng dụng vào quá trình sản xuất nước mắm và các loại thực phẩm khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), ”Công nghệ enzyme”, NXB Nông nghiệp.
2. Nguyễn Lân Dũng (1978), “Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học“, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
3. Nguyễn Lân Dũng (người dịch) (1983), “Thực tập vi sinh vật học”, NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội.
4. Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Ngô Xuân Mạnh, Lê Thanh Bình, Vandamme Peter (2011), “Định tên loài vi khuẩn sinh axit lactic bằng phương pháp phân tích trình tự gene PheS”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2011: Tập 9, số 3, 415 – 421.
5. Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp (2010), “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại”, Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học. 6. Lê Xuân Phương (2001), “Vi sinh vật công nghiệp”, NXB Xây Dựng, Hà Nội.
7. Hồ Trung Thông, Hồ Lê Quỳnh Châu (2009), “Nghiên cứu khả năng sống sót trong môi trường đường tiêu hóa của động vật của một số chủng vi sinh vật nhằm từng bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotic”, Tạp chí Khoa học (55), Đại học Huế, tr. 81-94.
8. Đỗ Thị Bích Thủy (2005), ”Thu nhận chế phẩm protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm”, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Bộ Giáo dục và Đào tạo, Đại học Đà Nẵng.
9. Trần Linh Thước (2003), “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm”, NXB Giáo Dục.
10.Nguyễn Xuân Trạch (2003), “Sử dụng phụ phẩm nuôi gia súc nhai lại”, NXB Nông nghiệp.
11.Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), ”Enzyme vi sinh vật tập I”, NXB Khoa học và kỹ thuật.
12.Lê Ngọc Tú, La Văn Chú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), ”Enzyme vi sinh vật tập III”, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
Tiếng Anh
13.Abdulla A.A, Abed A.T, Saeed M.A (2014), “Adhesion, Autoaggregation and Hydrophobicity of Six Lactobacillus Strains”, British Microbiology Research Journal 4, 381-391.
14.Allameh S. K., Daud H., Yusoff F. M., Saad C. R. and Ideris A. (2012), “Isolation, identification and characterization of Leuconostoc mesenteroides as a new probiotic from intestine of snakehead fish (Channa striatus)”, African Journal of Biotechnology Vol. 11(16), pp. 3810-3816.
15.Ariole C.N. và Kanu N. A. (2013), “Bacterial Flora Associated with Intestine of Tropical Estuarine Fish Species”, Journal of Chemical, Biological and Physical Sciences, Vol. 4, No. 1; 209-215.
16.Askari G.A., (2012), “Screenings of Lactic Acid Bacteria Isolated from Dried Fruits and Study of Their Antibacterial Activity”, Maroc Middle-East Journal of Scientific 11, pp. 209-215.
17.Austin B., A1-Zahrani AMJ. (1988), “The effect of antimicrobial compounds on the gastrointestinal microflora of rainbow trout”, Salmo gairdneri, Richardson. J Fish Biol 33, pp. 1-14.
18.Axelsson L (2004), “Lactic Axit Bacteria: Classification and Physiology, in:
Lactic Axit Bacteria, Microbiological and Functional Aspects, 3rd edition”, Marcel Dekker Inc, New York, USA, pp. 1-67.
19.Batt C.A., (2000), “Lactobacillus”. In: Encyclopedia of food microbiology” (Robinson K., ed.), London: Academic Press.
20.Bizzini A., Greub G., (2010), “Matrix-assisted laser desorption ionization time- of-flight mass spectrometry, a revolution in clinical microbial identification”,
21.Cherkaoui A., Hibbs J., Emonet S., Tangomo M., Girard M., Francois P., Schrenzel J., (2010), “Comparison of two matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry methods with conventional phenotypic identification for routine identification of bacteria to the species level”, Journal of Clinical Microbiology 48, 1169-1175..
22.Corzo G., Gilliland S.E. (1999), “Bile Salt Hydrolase Activity of Three Strains of Lactobacillusacidophilus”, Journal of Dairy Science 82, pp. 472–480.
23.Dardir A.H. (2012), “In vitro Evaluation of Probiotic Activities of Lactic Acid Bacter Strains Isolated From Novel Probiotic Dairy Products”, Global Veterinaria 8, 190-196.
24.Das K.M. and Tripathi S.D., (1991), ”Studies on the digestive enzymes of grass carp, Ctenopharygodon idella (V )”, Aquaculure, 92, pp. 21-32.
25.Dhage K.P., (1968), “Studies of the digestive enzymes in the three specis of the major carps of India”, Journal of Biological Science, 11, pp. 63-74.
26.Dieckmann R., Graeber I., Kaesler I., Szewzyk U., von Döhren H., (2005), “Rapid screening and dereplication of bacterial isolates from marine sponges of the Sula Ridge by intact-Cell-MALDI-TOF mass spectrometry (ICM-MS)”,
Applied Microbiology and Biotechnology 67, 539-548.
27.Doan N.T.L., Van Hoorde K., M. Cnockaert, E. De Brandt, M. Aerts, B. Le Thanh and P. Vandamme (2012), “Validation of MALDI-TOF MS for rapid classification and identification of lactic acid bacteria, with a focus on isolates from traditional fermented foods in Northern Vietnam”, Letters in Applied Microbiology, 55, pp. 265-273.
28.FAO/WHO (2001), Joint expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria, Córdoba, Argentina.
29.FAO/WHO (2002), Joint working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food, Ontario, Canada.
30.Friedrich J., Gradias H., Mandin D., Chaumont J.P., (1999), “Screening fungi for synthesis of keratinolytic eyme”, Letters in applied Microbiology 28, 127-130. 31.Gatesoupe F.J. (1991), “The effect of three strains of lactic acid bacteria on the
production rate of rotifers, Brachionus plicatilis, and their dietary value for larval turbot, Scophthalmus maximus”, Aquaculture 96, 335 –342.
32.Grosu-Tudor S.S., Zamfir M., (2012), “Probiotic potential of some lactic acid bacteria isolated from Romanian fermented vegerables”, The Scientific World Journal 17.
33.Jamaly N., Benjouad A. and Bouksaim M. (2011), “Probiotic potential of
Lactobacillus strains isolated from known popular traditional moroccan dairy products”, British Microbiology Research Journal 1, 79-94.
34.Janković T, Frece J, Abram M, Gobin I (2012), “Aggregation ability of potential probiotic Lactobacillus plantarum strains”, International journal of sanitary engineering research, 19-24.
35.Joborn A., Olsson C., Westerdahl A., Dorsch M., Conway P.L., Kjellberg S., (1997b), “Characterization of a Carnobacterium sp. isolated from the intestine of Atlantic salmon Salmo salar, producing a low molecular weight growth inhibitor active against bacterial fish pathogens”. Strain K. J. Fish Dis. 20, pp. 383-392.
36.Juste A., Lievens B., Frans I., Marsh T.L., Klinge berg M., Michiels C.W., Willems K.A., (2008), “Geretic and physiological diversity of Tetragnococcus halophilus strains isolated from sugar anh salt rich environment”, Microbilogy
154, pp. 2600-2610.
37.Kar N., Ghosh K., (2008),” Enzyme Producing Bacteria in the Gastrointestinal Tracts of Labeo rohita (Hamilton) and Channa punctatus (Bloch)”, Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 8, pp. 115-120.
38.Karimpour F., (2013), “Investigation of lactic acid bacteria isolated from domestic Iranian product Richal Masti Food & Drug and Social Determinants of Health Research Center”, Life Science Journal 10, pp. 513-516.
39.Kawai, S. and Ikeda, S., (1972), “Studies on digestive enzymes of fishes. Effect of dietary change on the activities of digestive enzymes in carp intestine”. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish38, pp. 265-270.
40.Keys, C.J., Dare, D.J., Sutton, H., Wells, G., Lunt, M., McKenna, T., McDowall, M., Shah, H.N., (2004), “Compilation of a MALDI-TOF mass spectral database for the rapid screening and characterisation of bacteria implicated in human infectious diseases”. Infection, Genetics and Evolution 4, 221-242.
41.Kim D.H; Kim D.Y; (2013), “Microbial diversity in the intestine of olive flounder (Paralichthys olivaceus)”, Aquaculture, Volume 414-415, pp 103-108. 42.Kim P.I., Jung M.Y., Chang Y.H., Kim S., Kim S.J., Park Y.H. (2007), “Probiotic
properties of Lactobacillus and Bifidobacterium strains isolated from porcine gastrointestinal tract”, Applied Microbiology Biotechnology 74, pp. 1103-1111. 43.Kos B., Suskovic M.J., Vukovic S., Simpraga M., Frece1 J. (2003), “Adhesion
and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92”,
Journal of Applied Microbiology 94, pp. 981–987.,
44.Lee J., Yun H.S., Cho K.W., Oh S., Kim S.H., Chun T., Kim B., Whang K.Y., (2011), “Evaluation of probiotic characteristic so fnewly isolated Lactobacillus
spp,:Immunemodulation and longevity”, International Journal of Food Microbiology 148, pp. 80-86.
45.Lee S.A., (2010), “In vitro study of the Effect of pH and salt concentration on the growth of Lactic acid bacteria anh Mold”, International bacialaureate Extened Essay Biology.
46.Lee Y.K., Salminen S., (2009), Handbook of probiotics and prebiotics, 2nd
edition, John Wiley & Sons Inc, Canada.
47.Liong M.T., Shah N.P., (2005), “Axit and Bile Tolerance and Cholesterol Removal Ability of Lactobacilli Strains”, Journal of Dairy Science 88, pp. 55-66.
48.Maragkoudakis P.A., Zoumpopouloua G., Miarisa C., Kalantzopoulosa G., Potb B., Tsakalidou E., (2006), “Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from dairy products”, International Dairy Journal 16, pp. 189–199.
49.Maria V.P., (2006), “Molecular and physiological studies on the functionality of probiotic lactobacilli”, Doctor thesis on Biochemistry, Karlsruhe University, Argentina.
50.Marian M.C; (1990),” Bacterial flora of fishes: A review”, Microbial Ecology,
Volume 19, Issue 1, pp 21-41.
51.Marvin L.F., Roberts M.A., Fay L.B., (2003), “Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry”,
Clinica Chimica Acta 337 (2003) 11 –21.
52.Mendpara J., Parerh V., Vaghela S., Makasana A., Kunjadia P.D., Sanghvi G., Vaishnav D., Dave G.S., (2013), “Isolation and characterization of hight salt