Các chất đƣợc đem thử hoạt tính sinh học bằng phƣơng pháp thử độ độc tế bào. Đó là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thƣ ở điều kiện in vitro. Dòng tế bào ung thƣ đƣợc sử dụng ở nghiên cứu này là: MCF7 (Human breast carcinoma) - ung thƣ vú. Đây là tế bào ung thƣ ở ngƣời đƣợc cung cấp bởi Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật của Mỹ (American Type Culture Collection, viết tắt là ATCC). Các tế bào ung thƣ đƣợc nuôi cấy trong các mơi trƣờng ni cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phơi bị (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370C; độ ẩm 98%, vô trùng tuyệt đối). Sau một thời gian cấy chuyển, tế bào phát triển ở pha loãng sẽ đƣợc sử dụng để thử độc tính.
Mẫu thử đƣợc pha lỗng ở các nồng độ là 128; 32; 8; 2; 0,5 μg/ml trong dung môi DMSO. Bổ sung thêm 200μl dung dịch tế bào ung thƣ MCF-7 ở pha loãng nồng độ 3.104 tế bào vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trƣờng RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute). Giếng điều khiển có 200μl dung dịch tế bào 3.104 tế bào /ml, ủ ở 370
C/5% CO2. Sau 3 ngày thêm 50μl MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), 1mg/ml pha trong môi trƣờng nuôi cấy không huyết thanh, và ủ tiếp ở 370C/4 giờ; loại bỏ môi trƣờng, thêm 100μl DMSO lắc đều, đọc kết quả ở bƣớc sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) = (OD điều khiển – OD mẫu) / OD điều khiển. Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào MCF-7 bằng phần mềm máy tính table curve. [17, 20]
23 CHƢƠNG 2 - THỰC NGHIỆM 2.1. Dụng cụ và hóa chất 2.1.1. Dụng cụ - Bình cầu hai cổ (50 ml, 500 ml, 750 ml) - Phễu nhỏ giọt (100 ml)
- Phễu lọc thủy tinh đáy xốp - Sinh hàn có gắn bẫy dầu - Bình hút ẩm
- Máy khuấy từ gia nhiệt - Cân phân tích
- Máy lọc hút chân khơng
- Hệ thống cất quay chân không - Hệ thống làm khô dung môi - Tủ sấy - Tủ hốt 2.1.2. Hóa chất - Benzoylclorua (C6H5COCl) - KSCN - Ni(CH3COO)2.2H2O - [PdCl2(CH3CN)2] - Trietylamin(C2H5)3N - ClCH2COONa - Mopholin (morpholine): - C4H9N
- Thionyl clorua SOCl2 -C6H13N
- NH2NH2 - NaOH
- Chỉ thị benzophenon (C6H5)2CO - HCl
- Dung môi hữu cơ: axeton, metanol, etanol, đietyl ete, điclometan, cacbon tetraclorua, tetrahiđrofuran (THF), CS2.
24
2.1.3. Chuẩn bị hóa chất
KSCN đƣợc sấy khơ trong tủ sấy ở 80oC cho đến khi khối lƣợng không đổi. Các dung môi dùng cho phản ứng tổng hợp phối tử đƣợc làm khô trong hệ thống làm khô dung môi. Axeton và cacbon tetraclorua đƣợc làm khô bằng P2O5. Trietylamin và THF đƣợc làm khơ bằng Na, có sử dụng chất chỉ thị benzophenon (khi đã khan nƣớc, chỉ thị từ không màu sẽ chuyển sang màu xanh).
2.2. Tổng hợp phối tử
Từ nguyên liệu ban đầu là benzoyl clorua và các amin (C4H9N hoặc C6H13N), phối tử benzamiđin ba càng sẽ đƣợc tổng hợp qua 5 công đoạn:
2.2.1. Tổng hợp hai dẫn xuất của benzoylthioure
Sơ đồ tổng hợp:
Lắp hệ thống phản ứng gồm bình cầu hai cổ 500ml, một cổ lắp sinh hàn có gắn bẫy dầu, một cổ lắp phễu nhỏ giọt 100 ml. Cho 58 ml benzoyl clorua
(dbenzoyl clorua = 1,21 g/ml, ~ 0,5 mol) vào phễu nhỏ giọt, cho thêm khoảng 20ml
axeton khô, rồi nhỏ từ từ vào bình cầu hai cổ chứa 53g KSCN sấy khơ (~0,55 mol) đã hòa tan trong axeton khan, khuấy đều bằng máy khuấy từ và đun nóng ở nhiệt độ 50oC trong 2h, để nguội bình phản ứng về nhiệt độ phòng rồi tiếp tục nhỏ từ từ 56,8ml đietylamin (dđietylamin = 0,7074 g/ml,~0,55 mol) hoặc 47,5ml morpholin
(dmopholin = 1,007 g/ml, ~0,55 mol) trong axeton vào bình phản ứng, khuấy đều hỗn
25
trong 2h. Khi phản ứng kết thúc, để nguội bình phản ứng về nhiệt độ phịng rồi rót hỗn hợp phản ứng vào cốc dung tích 1000 ml chứa nƣớc cất, khuấy nhẹ bằng đũa
thủy tinh sau đó lọc hút trên phễu thủy tinh đáy xốp thu đƣợc dẫn xuất của benzoylthioure ở dạng rắn màu trắng hơi vàng. Làm khơ sản phẩm trong khơng khí thu đƣợc: 90,5 g đietylbenzoylthioure (HEt2-Btu), hiệu suất ~ 75% và 95 g
morpholinbenzoylthioure (HMor-Btu) , hiệu suất ~ 76%.
2.2.2. Tổng hợp hai dẫn xuất phức chất niken(II) benzoylthioureato
Sơ đồ tổng hợp:
[Ni(Et2-btu)2]: R1 = R2 = Etyl [Ni(Mor-btu)2]: NR1R2 = Mopholin
Hòa tan 0,3 mol benzoylthioure trong etanol nóng trong cốc chịu nhiệt 500
ml, thêm dần dung dịch chứa 32 g muối Ni(CH3COO)2.2H2O (~0,15 mol) trong
metanol nóng vào dung dịch trên. Vừa khuấy vừa đun nóng nhẹ trong vịng 15 phút, sau đó để nguội về nhiệt độ phòng. Thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ tím đối với trƣờng hợp đietyl benzoylthioure và kết tủa màu đỏ nhạt hơn đối với trƣờng hợp morpholin benzoylthioure. Tiến hành lọc và sấy khô kết tủa, thu đƣợc 75,4 g [Ni(Et2-btu)2], hiệu suất ~ 95% và 78,5 g [Ni(Mor-btu)2], hiệu suất ~ 94%.
2.2.3. Tổng hợp hai dẫn xuất benzimiđoyl clorua
Tiến hành phản ứng thế nguyên tử O liên kết với Ni trong hai phức chất [Ni(Et2-btu)2] và [Ni(Mor-btu)2] bởi nguyên tử Cl bằng cách sử dụng thionyl clorua (SOCl2), thu đƣợc benzimiđoylclorua theo phƣơng trình phản ứng sau:
(Benzoyl thiorue)
26
Et2-bzm-Cl: R1 = R2 = Etyl Mor-bzm-Cl: NR1R2 = Mopholin
Lắp hệ thống phản ứng gồm bình cầu hai cổ 750 ml, một cổ lắp sinh hàn có gắn bẫy dầu, một cổ lắp phễu nhỏ giọt 100 ml.
Cân 52,9 g chất [Ni(Et2-btu)2] (~0,1 mol) hoặc 55,7 g [Ni(Mor-btu)2] (~0,1
mol) cho vào bình cầu, cho thêm vào 100 ml CCl4 khan, tiếp tục nhỏ từ từ 15,6 ml
SOCl2 (dthionyl clorua = 1,638 g/ml, 0,21 mol, lấy dƣ 5%) trong CCl4 khan vào bình
phản ứng, tiến hành khuấy và đun nóng ở nhiệt độ 50oC. Khi đó hỗn hợp phản ứng dần chuyển sang màu xanh, đun và khuấy thêm khoảng 30 phút nữa cho đến khi
màu hỗn hợp phản ứng chuyển hồn tồn sang màu xanh thì nhanh chóng lọc nóng hỗn hợp phản ứng, thu lấy dịch lọc. Phễu để lọc yêu cầu phải khô. Dịch lọc thu đƣợc trong suốt và có màu vàng. Loại dung mơi CCl4 ở dịch lọc bằng máy cất quay chân không, khi cịn lại một ít dung mơi thì ngừng quay để benzimiđoyl clorua đƣợc kết tinh, sau đó tiếp tục cất quay đến thật khơ dung môi, đƣợc chất rắn tinh thể màu vàng sáng. Thu lấy sản phẩm và bảo quản trong lọ kín, đƣợc: 11,45 g Et2-bzm-Cl, hiệu suất ~ 45% và 13,43 g Mor-bzm-Cl, hiệu suất ~ 50%.
2.2.4. Tổng hợp hai loại 4,4’-điankylthiosemicacbazit
Thêm hỗn hợp gồm có 3 ml CS2 (0,05 mol) và 0,05 mol C4H9N hoặc C6H13N vào dung dịch chứa 2,1 g NaOH (0,05 mol) trong 40 ml H2O. Sau đó khuấy đều hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ tới khi phân lớp hữa cơ biến mất. Sau đó, thêm 5,8 g ClCH2COONa (0,2 mol) rồi để qua đêm. Thêm tiếp vào lƣơng dƣ
dung dịch HCl đặc. Sản phẩm của giai đoạn này thu đƣợc: 8,7 g carboxyl methyl N- pyrrolidinyl dithiocacbamate và 9,6 g carboxyl methyl N- azepinyl dithiocacbamate.
27
Hòa tan hết lƣợng đithiocacbamat ở trên vào trong 8 ml hydrazin hydrate 80% và 1,5 ml H2O rồi đun hồi lƣu dung dịch. Sau 60 phút, để nguội hỗn hợp phản
ứng, những tinh thề không màu bắt đầu tách ra. Tinh thể đƣợc lọc, rửa sạch bằng nƣớc cất và làm khô ở nhiệt độ thấp, thu đƣợc N-pyrrolidinyl thiosemicacbazit và N-azepinyl thiosemicacbazit với hiệu suất khoảng 40 – 50%.
2.2.5. Tổng hợp phối tử benzamiđin ba càng H2L Phƣơng trình phản ứng: Phƣơng trình phản ứng: H2LE5 : R1=R2 = Et, NR3R4 = NC4H8 H2LE7 : R1=R2 = Et, NR3R4 = NC6H12 H2LM5 : NR1R2 = Morpholin, NR3R4 = NC4H8 H2LM7 : NR1R2 = Morpholin, NR3R4 = NC6H12
Lắp hệ phản ứng gồm bình cầu hai cổ dung tích 50ml, một cổ lắp sinh hàn có gắn bẫy dầu.
Hòa tan 0,01 mol mỗi thiosemicacbazit trong 20 ml dung môi tetrahiđrofuran (THF) khan, tiếp theo cho 3,5 ml trietylamin khan (dtrietylamin = 0,7255 g/ml, ~ 0,025
mol, lấy dƣ 150%) vào bình phản ứng, khuấy đều, sau đó lại cho thêm 0,01 mol
(4,4’-điankyl Thiosemicacbazit) (Benzimiđoyl clorua)
28
benzimidoyl clorua và khuấy đều ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ. Sau đó
khuấy ở nhiệt độ 40oC trong 1 giờ. Tiến hành loại bỏ dung môi THF ở dịch lọc bằng máy cất quay chân không thu đƣợc chất rắn vàng nhạt, cho thêm vào đó 10 ml đietyl ete, tráng nhẹ sau đó để yên cho phối tử tự kết tinh. Khi phối tử đã kết tinh hồn tồn, bỏ phần dung dịch ở phía trên, rửa lại phối tử bằng một ít đietyl ete, sau đó làm khơ sản phẩm trong khơng khí, thu đƣợc các benzamiđin tƣơng ứng. Hiệu suất đạt khoảng 60 - 80 %.
2.3. Tổng hợp phức chất
2.3.1. Tổng hợp phức chất [Pd(HL)Cl]
Phƣơng trình phản ứng:
Hịa tan 0,1mmol [Pd(MeCN)2Cl2] trong 5ml CH2Cl2 thu đƣợc dung dịch màu nâu vàng. Thêm tiếp 0,1 mmol phối tử H2L, dung dịch chuyển nhanh sang màu vàng tƣơi. Với phối tử H2LM5 và H2LM7, kết tủa màu vàng dƣới dạng vi tinh thể tách ra ngay sau khi trộn, còn với phối tử H2LE5 và H2LE7, nếu để yên dung dịch sau khi trộn, những tinh thể lớn màu vàng của phức chất tách ra sau khoảng 1 giờ. Hiệu suất phản ứng tổng hợp các phức chất đều đạt hơn 90%.
2.3.2. Tổng hợp phức chất [{Pd(L)}3]
29
Hòa tan 0,1mmol [Pd(MeCN)2Cl2] trong 5ml CH2Cl2 thu đƣợc dung dịch màu nâu vàng. Thêm tiếp 0,1 mmol phối tử H2L, dung dịch chuyển nhanh sang màu vàng tƣơi. Thêm nhanh 3 ml MeOH, 3 giọt Et3N vào hỗn hợp phản ứng. Màu sắc
của dung dịch chuyển nhanh sang màu đỏ đậm. Đun hồi lƣu hỗn hợp phản ứng khoảng 60 phút rồi đề nguội về nhiệt độ phòng. Cho bay hơi chậm hỗn hợp phản
ứng thì thu đƣợc những vi tinh thể màu đỏ của các phức chất. Hiệu suất phản ứng đạt khoảng 70 %.
2.4. Các thông số kỹ thuật của máy đo áp dụng cho việc đo mẫu phức chất 2.4.1. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại IR 2.4.1. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại IR
Phổ hồng ngoại đƣợc ghi trên máy GX-Perkin Elmer-USA, tại Khoa Hóa học - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, mẫu đƣợc ép dạng viên rắn với KBr.
2.4.2. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ 1H NMR
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1
HNMR đƣợc ghi trên máy FT-NMRAVANCE- 500 (Brucker), tại Viện Hóa học - Viện Khoa học Việt Nam, dung mơi hịa tan là CDCl3.
30
2.4.3. Phƣơng pháp phổ khối ESI-MS
Phổ ESI-MS đƣợc đo trên máy AmaZonTM của Brucker, tại Đại học Quốc gia Singapor. Điều kiện ghi phổ: t0 = 1500C, tốc độ khí 5 l/phút, trong dung môi
MeOH.
2.4.4. Phƣơng pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể
Dữ liệu nhiễu xạ tia X đơn tinh thể của phức chất AME, AMM đƣợc đo trên máy nhiễu xạ tia X (STOE IPDS 2T) ở nhiệt độ 200K tại Viện Hóa học và Hóa Sinh - Đại học Tự do Berlin. Đối âm cực Mo với bƣớc sóng Kα (λ = 0,71073Å). Ảnh nhiễu xạ đƣợc ghi trên detector dạng đĩa trịn đƣờng kính 34 cm. Khoảng cách từ
tinh thể đến đĩa ghi ảnh là 10 cm. Q trình xử lí số liệu và hiệu chỉnh sự hấp thụ tia X bởi đơn tinh thể đƣợc thực hiện bằng phần mềm chuẩn của máy đo. Cấu trúc đƣợc tính tốn và tối ƣu hóa bằng phần mềm SHELXS-97.
2.5. Thử hoạt tính sinh học
Các mẫu hóa chất đƣợc thử hoạt tính sinh học tại phịng Hoạt tính Sinh học - Viện Hóa học - Viện Khoa học Việt Nam.
31
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thảo luận về quá trình tổng hợp và nghiên cứu phối tử
3.1.1. Tổng hợp phối tử H2L
Các phối tử H2L đƣợc tổng hợp theo tài liệu tham khảo [16], quy trình đƣợc chia làm năm cơng đoạn, trong đó bốn giai đoạn quan trọng đƣợc tóm tắt trong sơ đồ sau:
Giai đoạn 1 - Điều chế benzoylthioure
Tiến hành phản ứng thế giữa benzoyl clorua với kali thioxianat để tạo thành benzoyl isoxianat, tiếp theo cho thêm amin bậc hai vào để phản ứng với benzoyl isoxianat, thu đƣợc benzoylthioure:
32
Quá trình tổng hợp benzoylthioure đƣợc tiến hành trong điều kiện khan do vậy yêu cầu KSCN phải đƣợc sấy khô kỹ và dung môi axeton phải thật khan. Nếu mơi trƣờng phản ứng có lẫn nƣớc, chất đầu benzoyl clorua và chất trung gian benzoyl isoxianat (là những chất rất nhạy nƣớc) sẽ bị thủy phân tạo axit benzoic, HCl, HSCN. Các axit này sẽ tác dụng với amin R1R2NH tạo thành muối amoni tƣơng ứng, làm giảm hiệu suất tổng hợp và tăng lƣợng tạp chất trong sản phẩm.
Khi phản ứng kết thúc, cho hỗn hợp phản ứng vào cốc chứa nƣớc cất, lúc đó KSCN, KCl và amin dƣ sẽ tan vào nƣớc cịn benzoylthioure khơng tan và kết tủa tách ra khỏi hỗn hợp phản ứng. Nếu có benzoyl clorua hoặc benzoyl isothioxianat cịn dƣ, chúng sẽ bị thủy phân tạo axit benzoic, axit này cũng tan khá tốt trong nƣớc nên không ảnh hƣởng tới độ tinh khiết của sản phẩm. Sản phẩm thu đƣợc tinh khiết đủ để tiến hành các bƣớc tổng hợp tiếp theo mà không cần phải tinh chế lại.
Giai đoạn 2- Điều chế phức chất niken(II) benzoylthioureato
Tiến hành cho benzoylthioure tác dụng với muối niken axetat sẽ thu đƣợc phức chất niken(II) benzoylthioureato:
Benzoylthioure ít phân cực nên tan tốt trong các dung môi phân cực kém, nó hầu nhƣ khơng tan trong nƣớc, thực nghiệm cho thấy benzoylthioure tan tốt trong etanol nóng. Muối Ni(CH3COO)2.2H2O chỉ tan tốt trong dung mơi phân cực, nó tan nhiều trong nƣớc, trong metanol nóng. Do vậy dung mơi tốt nhất để tiến hành phản ứng này là hỗn hợp etanol - metanol. Hòa tan muối niken axetat trong metanol nóng, cịn benzoyl thioure thì hịa tan trong etanol nóng, sau đó trộn chung hai dung dịch lại với nhau để phản ứng xảy ra. Phức chất tạo thành trung hịa về điện và có khối lƣợng phân tử lớn nên không tan trong dung môi khá phân cực là hỗn hợp etanol - metanol.
33
Giai đoạn 3- Điều chế benzimiđoyl clorua
Cho phức chất niken(II) benzoylthioureato tác dụng với thionyl clorua SOCl2 trong dung môi khan CCl4 sẽ thu đƣợc benzimiđoyl clorua:
Phản ứng giữa phức chất niken(II) benzoylthioureato với SOCl2 cũng địi hỏi mơi trƣờng thật khan nƣớc. Phản ứng này sử dụng dung môi CCl4, dung mơi này hịa tan niken(II) benzoylthioureato tốt hơn axeton vì nó ít phân cực hơn và cũng vì thế CCl4 ít hấp thụ hơi nƣớc và dễ làm khơ hơn axeton. Nhƣợc điểm là CCl4 độc hơn so với axeton [21, 22].
Vì phản ứng tạo khí SO2 độc nên phải thực hiện trong tủ hốt hoặc dẫn khí sinh ra bằng ống dẫn có một đầu nhúng vào dung dịch kiềm để hấp thụ SO2. Phản ứng này phải sử dụng bẫy dầu, nó có tác dụng giúp khí SO2 thốt ra ngồi, tránh tăng áp suất có thể gây nổ hệ phản ứng đồng thời giúp cho hệ ln kín, ngăn cản sự khuếch tán của hơi nƣớc vào hỗn hợp phản ứng gây thủy phân benzimiđoyl clorua.
Giai đoạn 4 - Điều chế phối tử benzamiđin ba càng
Cho benzimiđoyl clorua phản ứng với amin hai càng 4,4’-diankyl thiosemicacbazit, có mặt Et3N sẽ thu đƣợc benzamiđin ba càng:
Chất đầu benzimiđoyl clorua rất nhạy nƣớc nên phản ứng đƣợc tiến hành trong dung mơi khan. Nếu có lẫn nƣớc, benzimiđoyl clorua bị thủy phân tạo thành
34
benzoylthioure. Dung môi sử dụng cho phản ứng này là tetrahiđrofuran THF, nó có ƣu điểm là ít hấp thụ hơi ẩm. THF ít phân cực hơn axeton nên dễ hịa tan các chất ít phân cực, giúp tăng đƣợc nồng độ các chất tham gia phản ứng. Những ƣu điểm vừa rồi thì CCl4 cũng có, tuy nhiên CCl4 lại độc hơn [21 - 23].
Một ƣu điểm của phản ứng giữa benzimiđoyl clorua với 4,4’-diankyl thiosemicacbazit với sự có mặt của trietylamin dƣ là có thể dựa vào lƣợng kết tủa trắng Et3NHCl tạo thành để nhận biết phản ứng vẫn còn xảy ra hay đã kết thúc. Nếu lƣợng kết tủa khơng tăng lên trong một thời gian dài, lúc đó phản ứng đã kết thúc.
3.1.2. Nghiên cứu phối tử H2L
3.1.2.1. Nghiên cứu phối tử H2L bằng phƣơng pháp IR
Bốn phối tử H2L đƣợc nghiên cứu bằng phƣơng pháp phổ hấp thụ hồng ngoại. Phổ IR của phối tử H2LE7 và H2LM5 đƣợc trình bày ở hình 3.1 và hình 3.2;
cịn phổ IR của phối tử H2LE5 và H2LM7 đƣợc trình bày ở hình 1 và hình 2 phần Phụ