3. Tóm tắt nội dung của đề tài
2.1.1.2. Thử nghiệm trên chíp thanh dao động để dò tìm AFP
Quy trình gắn cysteamine và GAD tối ưu nhất được lựa chọn và tiến hành trên chip, và được đánh giá bằng phương pháp đo độ lệch thanh dao động.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 2.1.5: Quy trình xử lý bề mặt thanh dao động có phủ Au
Trong quy trình này, BSA là một protein huyết tương bò. Chip sau khi gắn anti-AFP được xử lý tiếp với dung dịch BSA. Các phân tử BSA có kích thước nhỏ sẽ len lỏi vào các khe hở trên bề mặt chip, phản ứng với các nhóm -CHO tự do và ngăn không cho các protein lạ phản ứng với các nhóm -CHO này. Nếu không có BSA thì các protein lạ sẽ len lỏi vào các khe hở và phản ứng với các nhóm -CHO tự do trên bề mặt chip. Từ đó làm thanh dao động bị lệch không phải vì AFP, dẫn đến chẩn đoán không chính xác. Hình
Làm sạch chíp
Gắn Cysteamine
• Ngâm chíp trong dd cysteamine 5mM (pha với ethanol), trong 24h, to p. • Rửa lại bằng nước DI, xịt khô bằng N2.
Gắn GAD
• Ngâm chíp trong dd GAD 2,5% + Vitamin C 50mM + PBS pH 7.4, 2h, to p. • Rửa lại bằng nước DI, xịt khô N2.
Gắn kháng thể anti-
AFP
• Ngâm chíp trong dd anti-AFP 5ug/ml, 18h, 4oC . • Rửa lại bằng PBS pH 7.4, DI, N2.
Ngâm trong dd
BSA
• Ngậm chíp với dd BSA nồng độ 2%, 30 phút, to p.
• Rửa lại chíp trong PBS pH 7.4, DI, N2. • Đo độ lệch.
Gắn kháng nguyên
AFP
• Ngâm chíp trong dung dịch AFP có nồng nồng độ khác nhau (đã pha với dd PBS pH 7.4), 2h, to
p.
• Rửa chíp trong PBS pH 7.4, DI, N2. • Đo độ lệch.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
2.1.6 mô tả vai trò của BSA trong quy trình dó tìm kháng nguyên bằng chíp thanh dao động.
Hình 2.1.6: Vai trò của BSA.
2.1.2. Qui trình biến đổi bề mặt SiNx/SiO2
2.1.2.1. Khảo sát silane hóa bề mặt SiNx và SiO2 và vấn đề của SiNx
Quy trình silane hoá bề mặt SiNx và SiO2 được thực hiện với hợp chất silane là GOPTS và hiệu quả của quá trình được đánh giá thông qua phương pháp chụp ảnh huỳnh quang F-LCA gắn trên silane. Quy trình silane hoá bề mặt SiNx và SiO2 được thực hiện theo sơ đồ hình 2.1.7. Y Y Y Y Au Cysteamine GAD Anti-AFP Protein lạ BSA AFP
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 2.1.7: Sơ đồ quy trình silane với GOPTS trên bề mặt SiNx và SiO2
Để hình thành nhóm chức silanol trên bề mặt, các mẫu wafer được ngâm trong dung piranha, trong 5 phút.
Hình 2.1.8: Liên kết silanol trên bề mặt SiNx/SiO2.
Quá trình silane bề mặt được thực hiện với các chất có nhóm silane như 3- glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPTS) (hoặc với 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)).
Làm sạch mẫu
rửa lại bằng nước DI-> xịt khô bằng khí N2
Tạo nhóm silanol trên
bề mặt
• Ngâm mẫu trong dung dịch piranha, thời gian 5 phút. • Rửa lại bằng nước DI, xịt khô bằng N2.
Silanization bề mặt
• Ngâm mẫu trong dd GOPTS 2% (pha loãng từ nồng độ 100% trong Toluene), thời gian qua đêm, to
p.
• Rửa 2 lần trong dd Toluene, mỗi lần 5 phút, rửa lại bằng nước DI, xịt khô N2.
Gắn F-LCA
• Ngâm mẫu trong dd F-LCA 5ug/ml (pha loãng từ nồng độ 100ug/ml với PBS pH7.4).
• Rửa trong dd đệm PBS pH7.4, rửa lại bằng nước DI, xịt khô với N2.
Chụp ảnh huỳnh quang
• Mẫu sau khi rửa sạch được mang đi chụp ảnh huỳnh quang và đánh giá kết quả.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Phân tử GOPTS gồm 1 nhóm epoxy và 3 nhóm silane, còn phân tử APTES gồm một nhóm chức NH2 và 3 nhóm silane như trong hình 2.1.9:
Hình 2.1.9: Cấu tạo phân tử GOPTS và APTES [21].
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 2.1.10: Quá trình silane hoá trên bề mặt SiNx/SiO2 với các chất có nhóm silane. R là một nhóm chức (như là epoxy, amine,...) [21].
Trong đề tài này, quá trình silane hoá được thực hiện với GOPTS nồng độ 2% trong dung dịch toluene, ngâm mẫu qua đêm, ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các mẫu được rửa lại trong dung dịch toluene trong 5 phút, rửa 2 lần để loại bỏ các phần tử GOPTS và APTES hấp phụ vật lý trên bề mặt.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 5. Quá trình gắn F-LCA
6. Chụp ảnh huỳnh quang
F-LCA là protein lens culinaris agglutinin (LCA) gắn chất phát huỳnh quang fluorescein isothiocyanate (FITC). Cơ chế gắn F-LCA lên bề mặt là một nhóm amine của LCA sẽ phản ứng với nhóm epoxy của GOPTS như trong hình 2.1.11 dưới đây:
F-LCA GOPTS Amine bậc 2
Hình 2.1.11: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine và nhóm epoxy [21]
Như nhận định ban đầu, những mẫu SiO2 cho kết quả huỳnh quang tốt còn những mẫu SiNx hầu như không có huỳnh quang khi thực hiện silane theo quy trình này. Do đó, đã tiến hành xử lý plasma oxy bề mặt SiNx.
2.1.2.2. Xử lý bề mặt SiNx bằng plasma oxy
Quy trình xử lý bề mặt SiNx bằng plasma oxy và khảo sát hiệu quả của plasma được thực hiện như sơ đồ hình 2.1.12.
Hình 2.1.12: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx bằng plasma oxy.
Quá trình xử lý plasma oxy (2) được thực hiện với các thông số thời gian, lưu lượng khí oxy, công suất plasma ICP, áp suất hoạt động buồng phản ứng dựa trên công trình
nghiên cứu [15] thông qua thiết bị RIE 200ipB, SAMCO, Nhật Bản, tại Phòng Thí
1. Quá trình làm sạch 2. Quá trình xử lý plasma oxy 3. Tạo silanol trên bề mặt 4. Silanization bề mặt
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 2.1.13: Thiết bị RIE 200ipB, SAMCO, tại Phòng thí Nghiệm Công nghệ Nano.
Các quá trình (1, 3, 4, 5, 6) được thực hiện tương tự như trong mục 2.1.2.1 ở trên.
2.1.2.3. Tối ƣu hóa quy trình xử lý plasma oxy
Đã tiến hành tối ưu quá trình xử lý plasma oxy để xác định các thông số tối ưu của quá trình xử lý bằng cách lần lượt thay đổi các thông số thời gian xử lý, lưu lượng khí oxy, công suất plasma ICP. Các quá trình còn lại được thực hiện như trong mục 2.1.2.2.
Kết quả thu được, được áp dụng vào quy trình biến đổi bề mặt SiNx.
2.1.2.4. Áp dụng quy trình plasma tối ƣu để biến đổi bề mặt SiNx với GOPTS
Thực hiện quy trình biến đổi bề mặt SiNx như trong sơ đồ mục 2.1.2.2 với các thông số tối ưu của quá trình xử lý plasma.
2.1.2.5. Thử nghiệm APTES+GAD
APTES + GAD thường được dùng trong quá trình silane bề mặt SiO2/SiNx nên đã tiến hành thử nghiệm biến đổi bề mặt với các chất này và so sánh kết quả với GOPTS. Sau khi xử lý bề mặt SiNx bằng quy trình plasma oxy tối ưu, đã tiến hành xử lý cho APTES và sau đó là GAD phản ứng với mẫu. Kết quả cho thấy sử dụng kết hợp APTES+GAD sẽ cố định đươc nhiều protein hơn là sử dụng GOPTS.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 2.1.14: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD áp dụng các quy trình tối ưu hoá.
Kết quả thu được cho thấy hiệu quả biến đổi bề mặt SiNx của APTES+GAD tốt hơn GOPTS nên nó được sử dụng để biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động nhằm dò tìm DKK1.
2.1.2.6. Ứng dụng thanh dao động động để dò tìm DKK1
Các thanh dao động trên chíp với mặt trên phủ Au, mặt dưới là SiNx, được xử lý nhờ quy trình plasma+APTES+GAD tối ưu để biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động. Kết quả được đánh giá bằng việc đo độ lệch của các thanh dao động trước và sau khi gắn kháng nguyên.
Quy trình thực hiện được trình bày như trong sơ đồ hình 2.1.15 dưới đây:
Làm sạch mẫu
• Ngâm trong Acetone 5 phút ->ngâm trong ethanol 30s-> DI->N2 • Ngâm trong piranha 5 phút -> rửa lại bằng nước DI-> xịt khô N2.
Xử lý plasma
oxy
• Sau khi làm sạch, mẫu được mang đi xử lý plasma oxy với các thông số tối ưu: thời gian là 60 phút, lưu lượng khí oxy là 40 sccm, công suất plasma ICP là 300W.
Tạo nhóm silanol
• Ngâm mẫu trong dung dịch piranha, 5 phút để tạo nhóm silanol trên bề mặt. • Rửa lại bằng nước DI, xịt khô bằng N2.
Gắn APTES
• Ngâm mẫu trong dd APTES nồng độ 1%, thời gian 60 phút, to p. • Rửa bằng ethanol trong 15 phút, DI, N2.
Gắn GAD
• Ngâm mẫu trong dd GAD 2,5% trong đệm PBS pH7.4, thời gian 60 phút, to p. • Rửa bằng đệm PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2.
Gắn F- LCA
• Ngâm mẫu trong dd F-LCA 5ug/ml (pha loãng từ nồng độ 100ug/ml với PBS pH 7.4), 18h, 4oC.
• Rửa sạch bằng PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 2.1.15: Sơ đồ quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD nhằm thu nhận DKK1.
Trong quy trình này, vai trò của BSA cũng tương tự như trong mục 2.1.1.3. Cụ thể được mô tả như trong hình 2.1.16.
Làm
sạch chíp • Sau đó mang chíp đi xử lý plasma.
Tạo nhóm silanol bề mặt
• Xử lý plasma oxy với các thông số tối ưu. • Rửa lại chíp bằng nước DI, xịt khô N2.
Gắn APTES
• Ngâm chíp trong dd APTES 1%, trong 60 phút, to p.
• Rửa bằng đệm PBS pH 7.4, rửa lại bằng nước DI, xịt khô bằng N2.
Gắn GAD
• Ngâm chíp trong dd GAD 2% trong đệm PBS pH 7.4, 60 phút, to p. • Rửa bằng đệm PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2. Gắn kháng thể anti- DKK1
• Ngâm chíp trong dd anti-DKK1 5ug/ml, 18h, 4oC . • Rửa lại bằng PBS pH 7.4, DI, N2.
Ngâm trong dd
BSA
• Ngậm chíp với dd BSA nồng độ 2%, 30 phút, to p.
• Rửa lại chíp trong PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2. • Đo độ lệch.
Gắn kháng nguyên
DKK1
• Ngâm chíp trong dung dịch DKK1 có nồng nồng độ khác nhau (đã pha với dd PBS pH 7.4), 2h, to
p.
• Rửa chíp trong PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2. • Đo độ lệch.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 2.1.16: Vai trò của BSA trong trong quy trình APTES+GAD để biến đổi bề mặt
SiNx của thanh dao động.
2.2. Các phƣơng pháp và thiết bị khảo sát 2.2.1. F-LCA và kính hiển vi huỳnh quang
Ảnh huỳnh quang có được thông qua kính hiển vi huỳnh quang BX41 (Olympus) sử dụng bước sóng kích thích 490nm, tại LNT. F-LCA phát xạ ánh sáng huỳnh quang mạnh nhất ở bước sóng 520 nm (màu xanh lục). Thiết bị BX41 tại LNT như hình 2.2.1:
Hình 2.2.1: Kính hiển vi huỳnh quang BX41 (Olympus) tại LNT.
SiNx Anti - DKK1 DKK1 BSA GAD APTES
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Instrument, Phần Lan, tại LNT. Một máy đo góc tiếp xúc có các bộ phận sau: một ống nhỏ giọt chất lỏng, một đèn để chiếu qua giọt nước, một máy chụp ảnh.
Chùm sáng từ đèn khi chiếu qua giọt nước và được thu lại bởi máy ảnh sẽ cho ảnh có một vùng màu đen, đây chính là giọt nước.
Từ ảnh chụp đó, máy tính sẽ xử lý ảnh và tính toán ra góc tiếp xúc.
Hình 2.2.2: Thiết bị đo góc tiếp xúc CAM 101.
2.2.3. Khảo sát bằng enzim HRP
Một phương pháp nữa để đánh giá hiệu quả của quá trình biến đổi bề mặt là sử dụng phản ứng đổi màu nhờ enzim horseradish peroxidase (HRP) của dung dịch O-dianisidine và H2O2. Phản ứng đổi màu của dung dịch chỉ xảy ra khi có mặt enzim horseradish peroxidase. Phản ứng càng mạnh khi hàm lượng HRP được gắn lên GAD trên bề mặt càng lớn, càng chứng tỏ hiệu quả biến đổi bề mặt.
Dung dịch phản ứng bao gồm một cặp chất oxy hoá – khử gồm o-dianisidine 1mM (đóng vai trò là chất khử) và H2O2 (là chất oxi hóa) 1mM trong đệm phosphate pH 7.4 được chuẩn bị trong cốc thuỷ tinh. Cả 2 chất này đều là trong suốt, không có màu trước khi thí nghiệm. O-dianisidine đóng vai trò là chất cho proton H+ và khử H2O2 thành 2 phân tử nước, phản ứng này đòi hỏi phải có sự xúc tác của enzim HRP. Sau phản ứng thì o-dianisidine cũng bị oxi hóa trở thành dạng oxi hóa, quá trình diễn ra theo sơ đồ sau:
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Sau khi thực hiện xong phản ứng ELISA, những chip đã gắn được HRP sẽ tạo dung dịch có màu hồng do o-dianisidine mất 2 proton H+ để chuyển từ dạng khử sang dạng oxy hoá. Dung dịch chuyển từ không màu sang màu hồng có khả năng hấp thụ bước sóng 540nm được đo bằng máy quang phổ hấp thụ khả kiến.
2.2.4. Đo độ lệch
Độ lệch của thanh dao động được đo bằng thiết bị Scala, hãng sản xuất MecWin, Tây Ban Nha tại LNT.
Hình 2.2.3: Thiết bị Scala tại LNT
2.2.5. Các hoá chất sử dụng trong đề tài
Đề tài có sử dụng một số hoá chất được thể hiện trong bảng 2.2.1 dưới đây:
Bảng 2.2.1. Danh mục các hóa chất.
Stt Hóa chất Công thức hóa
học Xuất xứ
Trọng lƣợng phân tử
1 Acetone CH3COCH3 Merck, Đức M=58,08 g/mol
2 Ethanol C2H5OH Merck, Đức M=46,07 g/mol
o-dianisidine (dạng khử, không màu) Peroxidase se o-dianisidine (dạng oxi hóa, nâu) H2O2 +
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
(GOPTS) C9H2OO5Si M=234 g/mol
4 Cysteamine 95%wt C2H7NS Aldrich, Sigma M=77 g/mol
5 Glutaraldehyde
(GAD) 25%wt
C5H8O2 Aldrich, Sigma M=100,12 g/mol
6 BSA Aldrich, Sigma ~66 kDa
7 F-LCA Vector
Laboratory, USA
8 anti-AFP Insight
Genomics, USA
9 AFP Insight
Genomics, USA 70 kDa
10 Anti-DKK1 Aldrich, Sigma ~29kDa
11 DKK1 Aldrich, Sigma 35-40 kDa
12 Ascorbic acid
(vitamin C) C6H8O6 Aldrich, Sigma M=176,12 g/mol
13 Hydrogen peroxide
30%wt H2O2 Merck, Đức M=34,01 g/mol
14 Toluene C6H5CH3 Merck, Đức M=92,14 g/mol
15 Acid sulfuric 98%wt H2SO4 Merck, Đức M=98 g/mol
Ngoài ra, một số hóa chất được chuẩn bị tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano như: dung dịch đệm PBS, nước DI.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát qui trình biến đổi bề mặt Au
Đã tiến hành khảo sát quy trình gắn glutaraldehyde để xác định thời gian ngâm và nồng độ GAD tối ưu thông qua ảnh huỳnh quang của F-LCA được gắn trên GAD. Các thí nghiệm khảo sát được thực hiện trên các mẫu wafer có bề mặt phủ vàng. Sau quy trình làm sạch, các mẫu wafer được ngâm trong dung dịch cysteamine 5mM, trong 24h, ở nhiệt độ phòng.
3.1.1 Khảo sát thời gian ngâm GAD
Để khảo sát thời gian ngâm GAD, nồng độ GAD được giữ nguyên là 2,5%, chỉ thay đổi thời gian ngâm GAD. Số liệu cụ thể như trong bảng 3.1.1.
Bảng 3.1.1: Khảo sát thời gian ngâm GAD.
Thời gian (phút) 15 30 60 90 120
Đơn vị huỳnh quang tương đối 2,54 5,72 8,30 6,92 5,71
Kết quả cho thấy, thời gian ngâm GAD tối ưu là 60 phút. Nếu thời gian ngâm giảm đi thì GAD chưa phản ứng hết với các phân tử cysteamine trên bề mặt. Mặt khác, thời gian