3. Tóm tắt nội dung của đề tài
1.4 Các phƣơng pháp đánh giá hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Sử dụng một chất phát huỳnh quang (fluorescent probe) gắn với những nhóm chức của các phần tử sinh học như là protein, axít nucleic... Những protein, axít nucleic không có tính chất huỳnh quang thì không phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang và không thể quan sát được, nhưng khi chúng được gắn với các chất huỳnh quang thì sẽ quan sát dưới hính hiển vi huỳnh quang. Ví dụ, những kháng thể được đánh dấu huỳnh quang có thể được sử dụng để phát hiện các tế bào và các mô có sự hiện diện của các kháng nguyên đặc biệt và chúng được ghi nhận thông qua thiết bị kính hiển vi huỳnh quang. Một số chất huỳnh quang được thể hiện trong hình 1.4.1 [21].
Hình 1.4.1: Một số chất huỳnh quang, a) fluorescein isothiocyanate (FITC); b) 5-
carboxyfluorescein succinimidyl ester; c) 6-fluorescein-5-carboxamido hexanoic acid succinimidyl ester
Bản chất của hiện tượng là khi điện tử hấp thụ năng lượng sẽ chuyển lên các mức năng lượng cao hơn. Năng lượng này sau đó có thể được giải phóng dưới dạng phonon hoặc phát xạ photon ánh sáng. Trong luận văn này, protein LCA (lens culinaris
agglutinin) được gắn với chất huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocyanate). Khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang có đèn phát ra bước sóng kích thích khoảng 488nm - 495nm thì FITC sẽ bị kích thíchvà sau đó chuyển trở về mức cơ bản thì sẽ phát ra photon có bước sóng khoảng 520 nm.
1.4.1.2. Phƣơng pháp đo góc tiếp xúc
Phương pháp này khảo sát tính chất của bề mặt thông qua tương tác giữa bề mặt đó với các chất lỏng. Cụ thể trong luận văn này, là đo độ lệch dính ướt giữa bề mặt của
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
mẫu và nước được khảo sát. Một giọt nước trên bề mặt thủy tinh có khuynh hướng lan rộng ra, và trở nên dẹt đi. Còn trên bề mặt lá sen có xu thể gom lại thành những hạt gần như hình tròn.
Hình 1.4.2: Hình ảnh những giọt nước trên lá sen.
Trường hợp thứ nhất, giữa nước và thủy tinh, được gọi là hiện tượng thấm ướt, trong đó bề mặt chung giữa 2 chất rắn và chất lỏng càng lúc càng được mở rộng. Trường hợp thứ hai là không thấm ướt, trong nó chất rắn và chất lỏng có sự “kỵ nhau”, chúng có khuynh hướng giảm thiểu sự tiếp xúc nhau bằng việc giảm tối đa diện tích tiếp xúc giữa nước và lá sen.
Hình 1.4.3: Góc thấm ướt của nước trên thủy tinh (trái) và lá sen (phải) [30]. Hiện tướng thấm ướt và không thấm ướt có thể được đo đạc định lượng thông qua việc đo góc tiếp xúc θ:
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 1.4.4: Các trường hợp không thấm ướt, ít thấm ướt và thấm ướt tốt.
Góc tiếp xúc phụ thuộc vào tương tác bề mặt xảy ra trên 3 bề mặt: mặt phân giới giữa chất lỏng và chất khí (được đặc trưng bởi sức căng mặt ngoài lỏng-khí γlg), mặt phân giới giữa chất rắn và chất khí (được đặc trưng bởi sức căng mặt ngoài rắn-khí γsg) và mặt phân giới giữa chất rắn và chất lỏng (được đặc trưng bởi sức căng mặt ngoài rắn-lỏng γsl). Tuy nhiên, trong luận văn này tất cả các lần đo đều thực hiện với chất lỏng là nước và thực hiện trong không khí, cho nên góc tiếp xúc đo được chỉ phụ thuộc vào trạng thái bề mặt của mẫu rắn.
Hình 1.4.5: Sự phụ thuộc của góc tiếp xúc vào các dạng lực căng bề mặt.
Khi giọt lỏng nhỏ lên bề mắt rắn, tất cả chất rắn, lỏng, khí đều có khuynh hướng thu nhỏ diện tích tiếp xúc của các mặt phân giới, nhằm giảm năng lượng bề mặt rắn-lỏng, lỏng-khí, rắn-khí nhỏ nhất. Phương trình Young mô tả liên hệ giữa góc tiếp xúc và tương tác giữa 3 chất rắn-lỏng-khí:
γlgcosθ=γsg−γsl
Trong dó: γlv, γsv, γsl lần lượt là sức căng mặt ngoài của các bề mặt lỏng-khí, rắn – khí và rắn-lỏng, θ là góc tiếp. Khi bề mặt rắn được biến đổi hóa học, có thêm các nhóm chức trên bề mặt thì trang thái phân cực của bề mặt rắn thay đổi. Từ đó có thể làm thay đổi tính ái nước hoặc kỵ nước của bề mặt, tức là thay đổi góc tiếp xúc với nước. Ví dụ,
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
khi bề mặt vàng (Au) gắn kết các hợp chất cysteamine, glutaraldehyde, protein, … thì tính phân cực của các phần đuôi (nhóm chức tự do) sẽ quyết định góc tiếp xúc. Sau khi gắn cysteamine lên bề mặt Au, đầu SH sẽ quay vào bề mặt Au, còn đầu NH2 sẽ là đầu tự do quay ra ngoài và tương tác với nước khi đo góc tiếp xúc. Do trong nhóm NH2 thì N có độ âm điện mạnh và thu hút điện tử của 2 nguyên tử H về phía nó, nên nhóm này có tính phân cực, về phía N có nhiều điện tích âm hơn, còn 2 nguyên tử H có ít điện tích âm hơn. Do đó, NH2 có khuynh hưởng tương tác mạnh với nước cũng là phân tử phân cực, vì O có độ âm điện mạnh hút các điện tử của H. Khi đó góc tiếp xúc giữa bề mặt Au với nước sẽ giảm đi [25]. Đối với bề mặt Au sau khi gắn glutaraldehyde và protein, cũng xảy ra hiện tượng tương tự.
1.4.1.3. Phƣơng pháp phản ứng đổi màu nhờ enzim HRP
Một phương pháp nữa để đánh giá hiệu quả của quá trình biến đổi bề mặt là sử dụng phản ứng đổi màu nhờ enzim horseradish peroxidase (HRP) trong dung dịch O- dianisidine và H2O2. Phản ứng đổi màu của dung dịch chỉ xảy ra khi có mặt của enzim xúc tác là horseradish peroxidase. Như vậy, phản ứng càng mạnh khi làm lượng HRP được gắn lên GAD trên bề mặt càng lớn, chứng tỏ hiệu quả biến đổi bề mặt càng lớn.
Dung dịch phản ứng bao gồm một cặp chất oxy hoá – khử gồm o-dianisidine 1mM (đóng vai trò là chất khử) và H2O2 (là chất oxi hóa) 1mM trong đệm phosphate pH 7.4 được chuẩn bị trong cốc thuỷ tinh cả 2 chất này đều là trong suốt, không có màu trước khi thí nghiệm. O-dianisidine đóng vai trò là chất cho proton H+ và khử H2O2 thành 2 phân tử nước, phản ứng này đòi hỏi phải có sự xúc tác của enzim HRP. Sau phản ứng thì o-dianisidine cũng bị oxi hóa trở thành dạng oxi hóa, quá trình diễn ra theo sơ đồ sau:
Sau khi thực hiện xong phản ứng ELISA, những chip đã gắn được HRP sẽ tạo dung dịch có màu hồng do o-dianisidine mất 2 proton H+ để chuyển từ dạng khử sang dạng oxy hoá. Dung dich chuyển từ không màu sang màu hồng có khả năng hấp thụ bước sóng 540nm được đo bằng máy quang phổ.
1.4.2. Phƣơng pháp đo độ lệch thanh dao động để phát hiện chất đánh dấu sinh học
o-dianisidine (dạng khử, không màu) Peroxidase se o-dianisidine (dạng oxi hóa, nâu) H2O2 +
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
nguyên lý đo độ lệch của thanh dao động được như hình 1.4.6.
Hình 1.4.6: Mô tả nguyên lý đo độ lệch của thanh dao động [6].
Việc đo độ lệch của thanh dao động đạt được bằng việc sử dụng phương pháp độ lệch chùm quang (hình 1.4.6). Một chùm laze được chiếu vào điểm cuối của thanh dao động và chùm phản xạ sẽ được thu nhận bởi bộ phận thu nhận quang (photodetector). Khi thanh dao động bị uốn cong thì chùm laze phản xạ sẽ bị lệch so với ban đầu. Độ lệch của thanh dao động tương ứng với độ dịch chuyển của chùm phản xạ này trên detector.
Thông thường một hệ đo độ lệch được thiết kế để đo cùng một lúc nhiều chíp, các chíp này được đặt trên một giá đỡ. Hình 1.4.7 mô tả một hệ đo độ lệch các thanh dao động của một mảng các chíp.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 1.4.7: a) Hệ đo độ lệch thanh dao động của các chíp trên cùng một mảng;
b) Một chíp với 9 thanh dao động [22].
Sự thay đổi độ lệch của các thanh dao động trước và sau khi bắt giữ kháng nguyên tỉ lệ với ứng suất do lớp các kháng nguyên trên bề mặt cảm biến gây ra. Độ lệch của thanh dao động được xác định thông qua công thức dưới đây [23]:
. 3(1 ) 4 rect W t z k l Trong đó:
- topbottom: độ chênh lệch ứng suất mặt trên và mặt dưới của thanh dao động.
- krect: hằng số đàn hồi của thanh dao động dạng hình chữ nhật. - : tỉ số Poisson của thanh dao động.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Quy trình biến đổi bề mặt thanh dao động
2.1.1. Quy trình biến đổi bề mặt phủ Au
Trong phần này, chúng tôi tiến hành biến tính bề mặt phủ vàng của các mẫu wafer và các thanh dao động trên chíp.
2.1.1.1. Khảo sát mẫu wafer
Quy trình biến đổi bề mặt wafer phủ vàng như sơ đồ dưới đây:
Hình 2.1.1: Quy trình biến đổi bề mặt Au của mẫu wafer.
Cysteamine với nhóm chức thiol (-SH) sẽ phản ứng với Au trên bề mặt wafer như hình 2.1.2:
Làm sạch mẫu
• Ngâm trong Acetone 5 phút ->ngâm trong ethanol 30s-> DI->N2
• Ngâm trong piranha 5 phút -> rửa lại bằng nước DI-> xịt khô bằng N2.
Gắn Cysteamine
• Ngâm mẫu trong dd cysteamine 5mM (pha với ethanol), trong 24h, to p. • Rửa lại bằng nước DI, xịt khô bằng N2.
• Đem mẫu đi đo góc tiếp xúc.
Gắn GAD
• Ngâm mẫu trong dd GAD 2,5%, thời gian 15, 30, 60, 90, 120, 180 phút, to
p.
• Rửa lại bằng nước DI, xịt khô N2. • Đo góc tiếp xúc.
Gắn F-LCA
• Ngâm mẫu trong dd F-LCA 5ug/ml (pha loãng từ nồng độ 100ug/ml với PBS pH 7.4), 18h, to
p.
• Rửa lại bằng nước DI, xịt khô với N2. • Đo góc tiếp xúc nước và chụp huỳnh quang.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Au Hợp chất thiol Liên kết cho nhận giữa Au và nhóm SH
Hình 2.1.2: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au.
Cơ chế gắn GAD trên cysteamine được thể hiện thông qua hình 1.2.3:
Amine Hợp chất aldehyde Base Schiff
Hình 2.1.3: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine (-NH2) và nhóm aldehyde (-CHO).
Theo đó, nhóm amine (-NH2) của cysteamine sẽ phản ứng với nhóm aldehyde (- CHO) của glutaraldehyde.
Sản phẩm tạo ra là base Schiff là một chất amine bậc 3 có nối đôi kém bền. Để tạo amine bền hơn người ta sử dụng thêm chất khử NaCNBH3 để chuyển amine bậc 3 về amine bậc 2 không có liên kết đôi:
Hình 2.1.4: Quá trình khử của hợp chất NaCNBH3.
Tuy nhiên, NaCNBH3 là một chất rất độc nên trong đề tài đã được thay thể bằng vitamin C, là một chất khử an toàn. Vitamin C xúc tác phản ứng giữa nhóm amine (-NH2) với nhóm aldehyde (-CHO) và làm tăng hiệu suất tạo thành amine bền hơn.
2.1.1.2. Thử nghiệm trên chíp thanh dao động để dò tìm AFP
Quy trình gắn cysteamine và GAD tối ưu nhất được lựa chọn và tiến hành trên chip, và được đánh giá bằng phương pháp đo độ lệch thanh dao động.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 2.1.5: Quy trình xử lý bề mặt thanh dao động có phủ Au
Trong quy trình này, BSA là một protein huyết tương bò. Chip sau khi gắn anti-AFP được xử lý tiếp với dung dịch BSA. Các phân tử BSA có kích thước nhỏ sẽ len lỏi vào các khe hở trên bề mặt chip, phản ứng với các nhóm -CHO tự do và ngăn không cho các protein lạ phản ứng với các nhóm -CHO này. Nếu không có BSA thì các protein lạ sẽ len lỏi vào các khe hở và phản ứng với các nhóm -CHO tự do trên bề mặt chip. Từ đó làm thanh dao động bị lệch không phải vì AFP, dẫn đến chẩn đoán không chính xác. Hình
Làm sạch chíp
Gắn Cysteamine
• Ngâm chíp trong dd cysteamine 5mM (pha với ethanol), trong 24h, to p. • Rửa lại bằng nước DI, xịt khô bằng N2.
Gắn GAD
• Ngâm chíp trong dd GAD 2,5% + Vitamin C 50mM + PBS pH 7.4, 2h, to p. • Rửa lại bằng nước DI, xịt khô N2.
Gắn kháng thể anti-
AFP
• Ngâm chíp trong dd anti-AFP 5ug/ml, 18h, 4oC . • Rửa lại bằng PBS pH 7.4, DI, N2.
Ngâm trong dd
BSA
• Ngậm chíp với dd BSA nồng độ 2%, 30 phút, to p.
• Rửa lại chíp trong PBS pH 7.4, DI, N2. • Đo độ lệch.
Gắn kháng nguyên
AFP
• Ngâm chíp trong dung dịch AFP có nồng nồng độ khác nhau (đã pha với dd PBS pH 7.4), 2h, to
p.
• Rửa chíp trong PBS pH 7.4, DI, N2. • Đo độ lệch.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
2.1.6 mô tả vai trò của BSA trong quy trình dó tìm kháng nguyên bằng chíp thanh dao động.
Hình 2.1.6: Vai trò của BSA.
2.1.2. Qui trình biến đổi bề mặt SiNx/SiO2
2.1.2.1. Khảo sát silane hóa bề mặt SiNx và SiO2 và vấn đề của SiNx
Quy trình silane hoá bề mặt SiNx và SiO2 được thực hiện với hợp chất silane là GOPTS và hiệu quả của quá trình được đánh giá thông qua phương pháp chụp ảnh huỳnh quang F-LCA gắn trên silane. Quy trình silane hoá bề mặt SiNx và SiO2 được thực hiện theo sơ đồ hình 2.1.7. Y Y Y Y Au Cysteamine GAD Anti-AFP Protein lạ BSA AFP
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 2.1.7: Sơ đồ quy trình silane với GOPTS trên bề mặt SiNx và SiO2
Để hình thành nhóm chức silanol trên bề mặt, các mẫu wafer được ngâm trong dung piranha, trong 5 phút.
Hình 2.1.8: Liên kết silanol trên bề mặt SiNx/SiO2.
Quá trình silane bề mặt được thực hiện với các chất có nhóm silane như 3- glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPTS) (hoặc với 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)).
Làm sạch mẫu
rửa lại bằng nước DI-> xịt khô bằng khí N2
Tạo nhóm silanol trên
bề mặt
• Ngâm mẫu trong dung dịch piranha, thời gian 5 phút. • Rửa lại bằng nước DI, xịt khô bằng N2.
Silanization bề mặt
• Ngâm mẫu trong dd GOPTS 2% (pha loãng từ nồng độ 100% trong Toluene), thời gian qua đêm, to
p.
• Rửa 2 lần trong dd Toluene, mỗi lần 5 phút, rửa lại bằng nước DI, xịt khô N2.
Gắn F-LCA
• Ngâm mẫu trong dd F-LCA 5ug/ml (pha loãng từ nồng độ 100ug/ml với PBS pH7.4).
• Rửa trong dd đệm PBS pH7.4, rửa lại bằng nước DI, xịt khô với N2.
Chụp ảnh huỳnh quang
• Mẫu sau khi rửa sạch được mang đi chụp ảnh huỳnh quang và đánh giá kết quả.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Phân tử GOPTS gồm 1 nhóm epoxy và 3 nhóm silane, còn phân tử APTES gồm một nhóm chức NH2 và 3 nhóm silane như trong hình 2.1.9:
Hình 2.1.9: Cấu tạo phân tử GOPTS và APTES [21].
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 2.1.10: Quá trình silane hoá trên bề mặt SiNx/SiO2 với các chất có nhóm silane. R là một nhóm chức (như là epoxy, amine,...) [21].
Trong đề tài này, quá trình silane hoá được thực hiện với GOPTS nồng độ 2% trong dung dịch toluene, ngâm mẫu qua đêm, ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các mẫu được rửa lại trong dung dịch toluene trong 5 phút, rửa 2 lần để loại bỏ các phần tử GOPTS và APTES hấp phụ vật lý trên bề mặt.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 5. Quá trình gắn F-LCA
6. Chụp ảnh huỳnh quang
F-LCA là protein lens culinaris agglutinin (LCA) gắn chất phát huỳnh quang fluorescein isothiocyanate (FITC). Cơ chế gắn F-LCA lên bề mặt là một nhóm amine của LCA sẽ phản ứng với nhóm epoxy của GOPTS như trong hình 2.1.11 dưới đây: