3. Tóm tắt nội dung của đề tài
1.2.3. Hệ kháng thể-kháng nguyên
Kháng nguyên là yếu tố lạ đối với cơ thể có khả năng gây đáp ứng miễn dịch. Không phải tất cả các vật lạ khi xâm nhập vào cơ thể đều là kháng nguyên, chúng phải có kích cỡ ít nhất bằng kích cỡ của một Epitope (nhóm quyết định kháng nguyên) mới có thể gây ra đáp ứng miễn dịch.
Kháng nguyên có 3 đặc tính cơ bản là tính sinh kháng thể, tính đặc hiệu và tính đa trị kháng nguyên.
Người ta phân loại kháng nguyên thành 2 loại: kháng nguyên hoàn toàn (antigen) là loại kháng nguyên có đầy đủ tính sinh kháng thể, tính đặc hiệu và kháng nguyên không hoàn toàn (hapten) còn gọi là bán kháng nguyên, là những kháng nguyên chỉ có tính đặc hiệu.
Kháng thể còn được gọi là các globulin miễn dịch hay immunoglobulin, kí hiệu là Ig. Ig được sinh ra khi cơ thể bị kháng nguyên kích thích, chúng có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên kích thích sinh ra chúng. Cấu trúc của một kháng thể được thể hiện trong hình 1.2.8.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 1.2.8: Cấu trúc điển hình của một kháng thể.
Phân tử kháng thể được cấu tạo từ bốn chuỗi polypeptide, liên kết với nhau bằng cầu nối dissulfur (-s-s), trong đó có hai chuỗi nặng H giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹL cũng giống hệt nhau. Kháng thể được chia thành nhiều lớp khác nhau: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Trong các lớp globulin miễn dịch có IgG chiếm khoảng 75-85% tổng số globulin miễn dịch của cơ thể. Chúng có cấu trúc gần giống nhau gồm chuỗi nặng và nhẹ, cấu trúc chuỗi nhẹ của các loại kháng thể này nói chung là như nhau, chúng chỉ có khác nhau ở chuỗi nặng. Bề mặt của kháng thể IgG được mô tả như trong hình 1.2.9.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
tương ứng nhờ các vùng biến đổi. Khi kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể do kháng nguyên đã kích thích sinh ra thì phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể xảy ra một cách đặc hiệu.(hình 1.2.10).
Hình 1.2.10: Sự gắn kết kháng nguyên-kháng thể.
Phản ứng kháng nguyên - kháng thể là cơ sở để xây dựng những phương pháp, kỹ thuật miễn dịch học thường sử dụng trong mục đích y học như chẩn đoán các bệnh ung thư, bệnh truyền nhiễm, bệnh kí sinh trùng, kỹ thuật xét nghiệm y học, thú y học, sinh học...
1.2.4. Chất chỉ thị ung thƣ gan AFP và DKK1 1.2.4.1. Chất chỉ thị AFP
Alpha-fetoprotein (AFP) là một chất chỉ thị được các nhà khoa học nghiên cứu, căn cứ để chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh ung thư biểu mô gan từ lâu. Hàm lượng AFP trong máu của những người khoẻ mạnh bình thường nằm trong khoảng từ 0 đến 10 ng/ml. Hàm lượng này tăng lên bất thường (vượt quá 400ng/ml)[5] ở những bệnh nhân mắc bệnh HCC, lúc này bác sỹ có thể kết luận bệnh nhân bị ung thư gan. Theo dõi hàm lượng AFP trong máu cũng giúp bác sỹ kiểm tra hiệu quả chữa trị bệnh nhân ung thư biểu mô gan. Nếu tình trạng bệnh nhân thuyên giảm thì hàm lường AFP cũng giảm dần và ngược lại. Tuy nhiên, ở người bị nhiễm virút viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C thì hàm lượng AFP luôn cao hơn mức bình thường (10-100ng/ml). Trong trường hợp này, cần thực hiện thêm một số phương pháp kiểm tra khác nữa để có kết luận có mắc ung thư gan hay không.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
AFP là một glycoprotein với cấu trúc gồm 590 amino acid và một phân tử carbohydrate, với khối lượng phân tử cỡ 70 kDa. AFP là một protein quan trọng của huyết tương và do túi phôi của phôi thai hay theo một số tài liệu thì do gan của phôi sản sinh ra. Protein này được cho là bản sao của albumin huyết thanh. Gen mã hóa AFP và albumin cùng có mặt ở vị trí đối diện trên nhiễm sắc thể số 4. AFP được tìm thấy ở các dạng cấu trúc bậc 1, bậc 2, bậc 3 và gắn kết với nguyên tố đồng (Cu), niken (Ni), acid béo và bilirubin [10],[11].
Trong giai đoạn phôi thai, AFP gắn với hormone estradiol và được định lượng thông qua máu của người mẹ hoặc dịch màng ối. Trường hợp hàm lượng AFP tăng cao bất thường thì nhiều khả năng là phôi thai có vấn đề liên quan đến sự phát triển của hệ thần kinh hay thoát vị rốn hoặc hội chứng Down. Sau khi được sinh ra, hàm lượng AFP của bé mới sinh giảm dần cho tới khi đạt mức chuẩn của người lớn bình thường trong khoảng từ 8-12 tháng tuổi.
1.2.4.2. Chất chỉ thị DKK1
Mặc dù chỉ thị AFP được nghiên cứu từ rất lâu trong chẩn đoán ung thư gan nhưng trong một số trường hợp giá trị của nó không cho ta kết luận chính xác. Gần đây, một số nhà khoa học đã bắt đầu quan tâm đến chất chỉ thị Dickkopf-1 (DKK1) trong chẩn đoán ung thư biểu mô gan.
DKK1 là một thành viên trong gia đình protein DKK bao gồm DKK1, DKK2, DKK3 và DKK4. Protein DKK1 là một glycoprotein có khối lượng phân tử 35-40 kDa bao gồm 235 amino axít [28].
Hàm lượng DKK1 cao là tiên lượng xấu cho khả năng mắc bệnh HCC, hàm lượng DKK1 tăng cao với những người mắc HCC giai đoạn đầu, ngay cả khi hàm lượng AFP đang ở mức bình thường [12]. Theo công trình nghiên cứu [12], hàm lượng DKK1 được tìm thấy ở mức độ cao trong dòng tế bào di căn của HCC là MHCC97-L và HCCLM3.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 1.2.11: Sự phụ thuộc của khả năng sống sót theo thời gian sau khi phẫu thuật liên
hệ với hàm lượng DKK1 của những bệnh nhân HCC [12].
1.3. Các phƣơng pháp biến đổi bề mặt để ứng dụng cảm biến thanh dao động trong việc phát hiện ung thƣ gan việc phát hiện ung thƣ gan
Như đã mô tả về cấu trúc thanh dao động nghiên cứu trong luận văn này, thanh dao động là vật liệu SiNx được phủ một lớp màng mỏng Au. Để bắt giữ được các chất chỉ thị sinh học phải tiến hành biến đổi bề mặt của thanh dao động theo hai hướng: liên kết giữa vàng với các hợp chất thiol hoặc liên kết giữa bề mặt SiNx với với các hợp chất silane.
1.3.1. Biến đổi bề mặt Au
Đối với bề mặt Au, trong luận văn này sử dụng các hợp chất thiol và các chất kết nối để biến đổi bề mặt sau:
- Trước tiên cho cysteamine (SHCH2CH2NH2) phản ứng với bề mặt Au. Cysteamine sẽ gắn với Au thông qua nhóm thiol (-SH).
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
- Tiếp theo cho chất glutaraldehyde (CHO(CH2)3CHO) gắn với cysteamine thông qua nhóm chức aldehyde của GAD và -NH2 của cysteamine. Kết quả thu được, bề mặt Au gắn GAD chứa nhóm chức aldehyde sẵn sàng để gắn các phần tử sinh học.
Thông thường, người ta sử dụng các hợp chất thiol để cổ định trên bề mặt vàng thông qua phản ứng Au-thiol. Cơ chế của phản ứng được thể hiện trong hình 1.3.1:
Au Hợp chất thiol Liên kết cho nhận giữa Au và nhóm -SH
Hình 1.3.1: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au.[21]
Một chất thường dùng trong biến đổi bề mặt Au của thanh dao động là cysteamine, có công thức phân tử là C2H7NS, công thức cấu tạo như thể hiện trong hình 1.3.2:
Hình 1.3.2 : Công thức cấu tạo của cysteamine
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng cysteamine cùng với một chất tạo kết nối là GAD để biến đổi bề mặt Au của thanh dao động.
1.3.2. Biến đổi bề mặt SiNx
1.3.2.1. Phƣơng pháp biến đổi và vấn đề đối với SiNx
Tương tự với bề mặt Au, SiNx cũng là một hợp chất khá trơ và không phản ứng với các hợp chất sinh học. Để cố định các phần tử sinh học trên bề mặt SiNx thì phải biến đổi nó.
Đối với bề mặt SiNx, trong luận văn này sử dụng các hợp chất silane và các chất kết nối để biến đổi bề mặt sau:
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
- Tiếp theo cho chất glutaraldehyde (CHO(CH2)3CHO) gắn với APTES thông qua nhóm chức aldehyde của GAD và –NH2 của APTES. Kết quả là thu được bề mặt SiNx gắn GAD chứa nhóm chức (-CHO) sẵn sàng để gắn các phần tử sinh học.
Mục đính của việc biến đổi bề mặt SiNx là tạo ra các nhóm silanol (SiOH) trên bề mặt, từ đó có thể phản ứng với các hợp chất silane (Si(OR)3) (như là GOPTS hay
APTES...). Đối với SiO2 thì việc tạo ra các nhóm chức silanol có thể thực hiện đơn giản bằng cách ngâm trong dung dịch piranha. Tuy nhiên, với SiNx lại không tạo ra được nhóm silanol bằng cách này.
Có một số phương pháp biến tính bề mặt SiNx để gắn các phần tử sinh học đã được nghiên cứu và báo cáo như phương pháp sử dụng bức xạ tử ngoại ở nhiệt độ phòng [13], sử dụng hoá chất như dung dịch NaOH, HF, phương pháp xử lý bằng plasma oxy [13], [14], [15]... Trong đề tài này, bề mặt thanh dao động của chíp có phủ một lớp vàng nên cần hạn chế sử dụng hoá chất ăn mòn mạnh như HF. Hơn nữa, với những điều kiện về trang thiết bị hiện có chúng tôi chọn phương pháp xử lý plasma oxy để biến tính bề mặt SiNx trong đề tài này.
1.3.2.2. Vai trò của xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O21.3.2.2.1. Giới thiệu về plasma O2 1.3.2.2.1. Giới thiệu về plasma O2
Plasma O2 là một hỗn hợp gồm các hạt phân tử oxy trung hoà, các điện tử, các iôn âm, và các iôn dương oxy. Chúng được tạo ra do quá trình iôn hoá các phân tử oxy dưới tác dụng của điện trường, từ trường hay những tia lửa điện. Các phân tử oxy trong môi trường plasma tồn tại ở các mức năng lượng khác nhau, do nhận thêm năng lượng nên một số phân tử oxy ở trạng thái kích thích. Những phân tử này trở nên hoạt hoá hơn bình thường, dó đó có thể xảy ra một số phản ứng hoá học mà ở trạng thái không kích thích không thể xảy ra.
1.3.2.2.2. Một số kỹ thuật tạo plasma
Có nhiều kỹ thuật khác nhau để tạo plasma. Tuy nhiên, tất cả chúng đều có chung một nguyên tắc đó là phải cung cấp một năng lượng đủ lớn để tạo ra và duy trì plasma.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Điểm khác biệt giữa các kỹ thuật này là phương pháp tạo ra plasma. Dưới đây là một số kỹ thuật tạo plasma phố biến hiện nay.
Plasma GDP, một hiệu điện thế một chiều được áp vào giữa 2 bản kim loại, gọi là anod và cathode. Ban đầu, trong khối khí trung hòa có tồn tại một ít các hạt bị ion hóa tự phát và một ít electron. Các hạt mang điện này sẽ bị gia tốc bởi điện trường và va chạm với các hạt trung hòa khác, làm ion hóa, sinh ra các ion và electron mới. Quá trình sẽ tái diễn và cuối cùng trong khối khí giữa cathode và anod sẽ chứa rất nhiều hạt mang điện và ở trang thái kích thích, tức là đã trở thành plasma. Thiết bị plasma phóng điện khí yêu cầu phải có hiệu thế giữa 2 bản cực rất cao. Một nhược điểm khác là điện thế gia tốc sẽ làm cho các electron và ion va đập bề mặt của 2 bản cực theo phương thẳng đứng với năng lượng lớn, làm mòn dần bản cực và các chi tiết cần làm sạch/ăn mòn của thiết bị đặt trên bản cực cũng bị bắn phá.
Capacitively coupled plasma (CCP) là kỹ thuật tạo plasma sử dụng phố biến nhất trong công nghiệp hiện nay. Cấu tạo gồm hai điện cực kim loại, đặt gần nhau trong một buồng phản ứng. Một trong hai điện cực này nối với cực dương của nguồn RF có tần số hoạt động bằng 13,56MHz, điện cực còn lại nối mát. Sóng RF có tác dụng iôn hoá chất khí nằm giữa 2 điện cực này tạo thành plasma. Vì cấu tạo của buồng phản ứng này giống như một tụ điện nên nó được gọi là kỹ thuật plasma CCP.
Hình 1.3.3: Cấu tạo buồng phản ứng của kỹ thuật CCP.
Inductively Coupled Plasma (ICP), trong thiết bị này, ngoài một điện thế áp vào giữa 2 cực, còn có một điện áp xoay chiều áp vào 2 đầu cuộn dây quấn dọc theo buồng. Khi cấp một dòng điện xoay chiều chạy qua cuộn dây sẽ sinh ra từ trường biến thiên
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
sóng điện từ làn truyền trong buồng plasma. Sóng này làm các electron và ion tự phát dao động và ion hóa các hạt trung hòa khác, làm cho buồng phản ứng trở thành plasma.
Ưu điểm của thiết bị plasma ICP là có thể điều khiển một cách độc lập điện từ trường gia tốc theo phương thẳng đứng (tức là hiệu thế áp vào giữa 2 bản cực) và điện từ trường theo phương ngang (tức là điều khiển dòng điện chạy trong cuộn cảm). Do đó, có thể dùng cuộn cảm để tạo plasma trong buồng chứa rất nhiều hạt ở trang thái kích thích, có hoạt hóa cao sử dụng làm sạch hoặc phản ứng tốt với lớp vật chất mỏng trên bề mặt mẫu (thường là chip, wafer), trong khi lại hầu như không bắn phá bề mặt mẫu theo phương thẳng đứng, giữ các chi tiết trên bề mặt mẫu không bị thay đổi. Buồng phản ứng của thiết bị tạo plasma ICP có dạng như hình 1.3.4:
Hình 1.3.4: Cấu tạo của buồng phản ứng của kỹ thuật ICP
Phương pháp làm sạch bề mặt bằng plasma oxy với hệ plasma ICP có ưu điểm là plasma chỉ tác động lên các chất bẩn nằm trên bề mặt của thiết bị muốn làm sạch, và hầu như không ảnh hưởng để các vi cấu trúc của thiết bị. Do đó, các chức năng, chất lượng của thiết bị được bảo toàn. Plasma oxy trong thiết bị ICP, có thể làm thay đổi tính chất
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
hóa học của lớp mỏng vật chất trên bề mặt mẫu mà không làm tổn hại sâu bên trong mẫu. Do đó, plasma oxy đã được chọn để xử lý bề mặt silicon nitride trong luận văn này.
1.3.2.2.3. Vai trò của plasma đối với bề mặt SiNx
Plasma oxy có vai trò rất quan trọng đối với bề mặt SiNx trong việc hình thành một màng mỏng Si2N2O, là cơ sở để tạo ra nhóm silanol trên bề mặt. Cơ chế hình thành màng Si2N2O thông qua 4 bước: (i) đầu tiên oxy được tiêm vào mặt tiếp giáp giữa oxít-plasma; (ii) tiếp đến, oxy được vận chuyển qua lớp oxít đang phát triển; (iii) sau đó, xảy ra sự biến đổi ở mặt tiếp giáp giữa oxít-nitride; (iv) cuối cùng, xảy ra sự vận chuyển N2 tới mặt tiếp giáp oxít-plasma [16],[17].
Khi trong buồng có O2 và năng lượng điện từ được cấp vào buồng, thì khí O2 bị ion hoá và kích thích, sẽ tạo nên các hạt như sau:
O2 O2*, O, O2+, O+, O-, e
Các mẫu oxy có hoạt tính hóa học cao sẽ phản ứng với Si trong SiNx, tạo thành SiOx. Ví dụ, mẫu O- sẽ phản ứng như sau [18]:
Si +2O- SiO2 +2e
Trong thực tế, các mẫu oxy sẽ phản ứng với Si và thế chỗ cho N:
Hình 1.3.5: Quá trình thay thể nguyên tử N của nguyên tử O [19]
Quá trình xảy ra dần dần và một lớp mỏng màng silicon nitride trên bề mặt sẽ chuyển thành silicon oxynitride Si2N2O:
Hình 1.3.6: Vai trò của plasma oxy đối với bề mặt SiNx [20]
Chính các nhóm SixOy sẽ chuyển thành SiOH trong bước biến đổi bề mặt và tham gia phảm ứng với các hợp chất silane sau này.
1.4. Các phƣơng pháp đánh giá hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động thanh dao động
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Sử dụng một chất phát huỳnh quang (fluorescent probe) gắn với những nhóm chức của các phần tử sinh học như là protein, axít nucleic... Những protein, axít nucleic không có tính chất huỳnh quang thì không phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang và không thể quan sát được, nhưng khi chúng được gắn với các chất huỳnh quang thì sẽ quan sát dưới hính hiển vi huỳnh quang. Ví dụ, những kháng thể được đánh dấu huỳnh quang có