3. Tóm tắt nội dung của đề tài
1.3. Các phƣơng pháp biến đổi bề mặt để ứng dụng cảm biến thanh dao động trong
việc phát hiện ung thƣ gan
Như đã mô tả về cấu trúc thanh dao động nghiên cứu trong luận văn này, thanh dao động là vật liệu SiNx được phủ một lớp màng mỏng Au. Để bắt giữ được các chất chỉ thị sinh học phải tiến hành biến đổi bề mặt của thanh dao động theo hai hướng: liên kết giữa vàng với các hợp chất thiol hoặc liên kết giữa bề mặt SiNx với với các hợp chất silane.
1.3.1. Biến đổi bề mặt Au
Đối với bề mặt Au, trong luận văn này sử dụng các hợp chất thiol và các chất kết nối để biến đổi bề mặt sau:
- Trước tiên cho cysteamine (SHCH2CH2NH2) phản ứng với bề mặt Au. Cysteamine sẽ gắn với Au thông qua nhóm thiol (-SH).
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
- Tiếp theo cho chất glutaraldehyde (CHO(CH2)3CHO) gắn với cysteamine thông qua nhóm chức aldehyde của GAD và -NH2 của cysteamine. Kết quả thu được, bề mặt Au gắn GAD chứa nhóm chức aldehyde sẵn sàng để gắn các phần tử sinh học.
Thông thường, người ta sử dụng các hợp chất thiol để cổ định trên bề mặt vàng thông qua phản ứng Au-thiol. Cơ chế của phản ứng được thể hiện trong hình 1.3.1:
Au Hợp chất thiol Liên kết cho nhận giữa Au và nhóm -SH
Hình 1.3.1: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au.[21]
Một chất thường dùng trong biến đổi bề mặt Au của thanh dao động là cysteamine, có công thức phân tử là C2H7NS, công thức cấu tạo như thể hiện trong hình 1.3.2:
Hình 1.3.2 : Công thức cấu tạo của cysteamine
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng cysteamine cùng với một chất tạo kết nối là GAD để biến đổi bề mặt Au của thanh dao động.
1.3.2. Biến đổi bề mặt SiNx
1.3.2.1. Phƣơng pháp biến đổi và vấn đề đối với SiNx
Tương tự với bề mặt Au, SiNx cũng là một hợp chất khá trơ và không phản ứng với các hợp chất sinh học. Để cố định các phần tử sinh học trên bề mặt SiNx thì phải biến đổi nó.
Đối với bề mặt SiNx, trong luận văn này sử dụng các hợp chất silane và các chất kết nối để biến đổi bề mặt sau:
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
- Tiếp theo cho chất glutaraldehyde (CHO(CH2)3CHO) gắn với APTES thông qua nhóm chức aldehyde của GAD và –NH2 của APTES. Kết quả là thu được bề mặt SiNx gắn GAD chứa nhóm chức (-CHO) sẵn sàng để gắn các phần tử sinh học.
Mục đính của việc biến đổi bề mặt SiNx là tạo ra các nhóm silanol (SiOH) trên bề mặt, từ đó có thể phản ứng với các hợp chất silane (Si(OR)3) (như là GOPTS hay
APTES...). Đối với SiO2 thì việc tạo ra các nhóm chức silanol có thể thực hiện đơn giản bằng cách ngâm trong dung dịch piranha. Tuy nhiên, với SiNx lại không tạo ra được nhóm silanol bằng cách này.
Có một số phương pháp biến tính bề mặt SiNx để gắn các phần tử sinh học đã được nghiên cứu và báo cáo như phương pháp sử dụng bức xạ tử ngoại ở nhiệt độ phòng [13], sử dụng hoá chất như dung dịch NaOH, HF, phương pháp xử lý bằng plasma oxy [13], [14], [15]... Trong đề tài này, bề mặt thanh dao động của chíp có phủ một lớp vàng nên cần hạn chế sử dụng hoá chất ăn mòn mạnh như HF. Hơn nữa, với những điều kiện về trang thiết bị hiện có chúng tôi chọn phương pháp xử lý plasma oxy để biến tính bề mặt SiNx trong đề tài này.
1.3.2.2. Vai trò của xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O21.3.2.2.1. Giới thiệu về plasma O2 1.3.2.2.1. Giới thiệu về plasma O2
Plasma O2 là một hỗn hợp gồm các hạt phân tử oxy trung hoà, các điện tử, các iôn âm, và các iôn dương oxy. Chúng được tạo ra do quá trình iôn hoá các phân tử oxy dưới tác dụng của điện trường, từ trường hay những tia lửa điện. Các phân tử oxy trong môi trường plasma tồn tại ở các mức năng lượng khác nhau, do nhận thêm năng lượng nên một số phân tử oxy ở trạng thái kích thích. Những phân tử này trở nên hoạt hoá hơn bình thường, dó đó có thể xảy ra một số phản ứng hoá học mà ở trạng thái không kích thích không thể xảy ra.
1.3.2.2.2. Một số kỹ thuật tạo plasma
Có nhiều kỹ thuật khác nhau để tạo plasma. Tuy nhiên, tất cả chúng đều có chung một nguyên tắc đó là phải cung cấp một năng lượng đủ lớn để tạo ra và duy trì plasma.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Điểm khác biệt giữa các kỹ thuật này là phương pháp tạo ra plasma. Dưới đây là một số kỹ thuật tạo plasma phố biến hiện nay.
Plasma GDP, một hiệu điện thế một chiều được áp vào giữa 2 bản kim loại, gọi là anod và cathode. Ban đầu, trong khối khí trung hòa có tồn tại một ít các hạt bị ion hóa tự phát và một ít electron. Các hạt mang điện này sẽ bị gia tốc bởi điện trường và va chạm với các hạt trung hòa khác, làm ion hóa, sinh ra các ion và electron mới. Quá trình sẽ tái diễn và cuối cùng trong khối khí giữa cathode và anod sẽ chứa rất nhiều hạt mang điện và ở trang thái kích thích, tức là đã trở thành plasma. Thiết bị plasma phóng điện khí yêu cầu phải có hiệu thế giữa 2 bản cực rất cao. Một nhược điểm khác là điện thế gia tốc sẽ làm cho các electron và ion va đập bề mặt của 2 bản cực theo phương thẳng đứng với năng lượng lớn, làm mòn dần bản cực và các chi tiết cần làm sạch/ăn mòn của thiết bị đặt trên bản cực cũng bị bắn phá.
Capacitively coupled plasma (CCP) là kỹ thuật tạo plasma sử dụng phố biến nhất trong công nghiệp hiện nay. Cấu tạo gồm hai điện cực kim loại, đặt gần nhau trong một buồng phản ứng. Một trong hai điện cực này nối với cực dương của nguồn RF có tần số hoạt động bằng 13,56MHz, điện cực còn lại nối mát. Sóng RF có tác dụng iôn hoá chất khí nằm giữa 2 điện cực này tạo thành plasma. Vì cấu tạo của buồng phản ứng này giống như một tụ điện nên nó được gọi là kỹ thuật plasma CCP.
Hình 1.3.3: Cấu tạo buồng phản ứng của kỹ thuật CCP.
Inductively Coupled Plasma (ICP), trong thiết bị này, ngoài một điện thế áp vào giữa 2 cực, còn có một điện áp xoay chiều áp vào 2 đầu cuộn dây quấn dọc theo buồng. Khi cấp một dòng điện xoay chiều chạy qua cuộn dây sẽ sinh ra từ trường biến thiên
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
sóng điện từ làn truyền trong buồng plasma. Sóng này làm các electron và ion tự phát dao động và ion hóa các hạt trung hòa khác, làm cho buồng phản ứng trở thành plasma.
Ưu điểm của thiết bị plasma ICP là có thể điều khiển một cách độc lập điện từ trường gia tốc theo phương thẳng đứng (tức là hiệu thế áp vào giữa 2 bản cực) và điện từ trường theo phương ngang (tức là điều khiển dòng điện chạy trong cuộn cảm). Do đó, có thể dùng cuộn cảm để tạo plasma trong buồng chứa rất nhiều hạt ở trang thái kích thích, có hoạt hóa cao sử dụng làm sạch hoặc phản ứng tốt với lớp vật chất mỏng trên bề mặt mẫu (thường là chip, wafer), trong khi lại hầu như không bắn phá bề mặt mẫu theo phương thẳng đứng, giữ các chi tiết trên bề mặt mẫu không bị thay đổi. Buồng phản ứng của thiết bị tạo plasma ICP có dạng như hình 1.3.4:
Hình 1.3.4: Cấu tạo của buồng phản ứng của kỹ thuật ICP
Phương pháp làm sạch bề mặt bằng plasma oxy với hệ plasma ICP có ưu điểm là plasma chỉ tác động lên các chất bẩn nằm trên bề mặt của thiết bị muốn làm sạch, và hầu như không ảnh hưởng để các vi cấu trúc của thiết bị. Do đó, các chức năng, chất lượng của thiết bị được bảo toàn. Plasma oxy trong thiết bị ICP, có thể làm thay đổi tính chất
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
hóa học của lớp mỏng vật chất trên bề mặt mẫu mà không làm tổn hại sâu bên trong mẫu. Do đó, plasma oxy đã được chọn để xử lý bề mặt silicon nitride trong luận văn này.
1.3.2.2.3. Vai trò của plasma đối với bề mặt SiNx
Plasma oxy có vai trò rất quan trọng đối với bề mặt SiNx trong việc hình thành một màng mỏng Si2N2O, là cơ sở để tạo ra nhóm silanol trên bề mặt. Cơ chế hình thành màng Si2N2O thông qua 4 bước: (i) đầu tiên oxy được tiêm vào mặt tiếp giáp giữa oxít-plasma; (ii) tiếp đến, oxy được vận chuyển qua lớp oxít đang phát triển; (iii) sau đó, xảy ra sự biến đổi ở mặt tiếp giáp giữa oxít-nitride; (iv) cuối cùng, xảy ra sự vận chuyển N2 tới mặt tiếp giáp oxít-plasma [16],[17].
Khi trong buồng có O2 và năng lượng điện từ được cấp vào buồng, thì khí O2 bị ion hoá và kích thích, sẽ tạo nên các hạt như sau:
O2 O2*, O, O2+, O+, O-, e
Các mẫu oxy có hoạt tính hóa học cao sẽ phản ứng với Si trong SiNx, tạo thành SiOx. Ví dụ, mẫu O- sẽ phản ứng như sau [18]:
Si +2O- SiO2 +2e
Trong thực tế, các mẫu oxy sẽ phản ứng với Si và thế chỗ cho N:
Hình 1.3.5: Quá trình thay thể nguyên tử N của nguyên tử O [19]
Quá trình xảy ra dần dần và một lớp mỏng màng silicon nitride trên bề mặt sẽ chuyển thành silicon oxynitride Si2N2O:
Hình 1.3.6: Vai trò của plasma oxy đối với bề mặt SiNx [20]
Chính các nhóm SixOy sẽ chuyển thành SiOH trong bước biến đổi bề mặt và tham gia phảm ứng với các hợp chất silane sau này.
1.4. Các phƣơng pháp đánh giá hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động thanh dao động
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Sử dụng một chất phát huỳnh quang (fluorescent probe) gắn với những nhóm chức của các phần tử sinh học như là protein, axít nucleic... Những protein, axít nucleic không có tính chất huỳnh quang thì không phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang và không thể quan sát được, nhưng khi chúng được gắn với các chất huỳnh quang thì sẽ quan sát dưới hính hiển vi huỳnh quang. Ví dụ, những kháng thể được đánh dấu huỳnh quang có thể được sử dụng để phát hiện các tế bào và các mô có sự hiện diện của các kháng nguyên đặc biệt và chúng được ghi nhận thông qua thiết bị kính hiển vi huỳnh quang. Một số chất huỳnh quang được thể hiện trong hình 1.4.1 [21].
Hình 1.4.1: Một số chất huỳnh quang, a) fluorescein isothiocyanate (FITC); b) 5-
carboxyfluorescein succinimidyl ester; c) 6-fluorescein-5-carboxamido hexanoic acid succinimidyl ester
Bản chất của hiện tượng là khi điện tử hấp thụ năng lượng sẽ chuyển lên các mức năng lượng cao hơn. Năng lượng này sau đó có thể được giải phóng dưới dạng phonon hoặc phát xạ photon ánh sáng. Trong luận văn này, protein LCA (lens culinaris
agglutinin) được gắn với chất huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocyanate). Khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang có đèn phát ra bước sóng kích thích khoảng 488nm - 495nm thì FITC sẽ bị kích thíchvà sau đó chuyển trở về mức cơ bản thì sẽ phát ra photon có bước sóng khoảng 520 nm.
1.4.1.2. Phƣơng pháp đo góc tiếp xúc
Phương pháp này khảo sát tính chất của bề mặt thông qua tương tác giữa bề mặt đó với các chất lỏng. Cụ thể trong luận văn này, là đo độ lệch dính ướt giữa bề mặt của
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
mẫu và nước được khảo sát. Một giọt nước trên bề mặt thủy tinh có khuynh hướng lan rộng ra, và trở nên dẹt đi. Còn trên bề mặt lá sen có xu thể gom lại thành những hạt gần như hình tròn.
Hình 1.4.2: Hình ảnh những giọt nước trên lá sen.
Trường hợp thứ nhất, giữa nước và thủy tinh, được gọi là hiện tượng thấm ướt, trong đó bề mặt chung giữa 2 chất rắn và chất lỏng càng lúc càng được mở rộng. Trường hợp thứ hai là không thấm ướt, trong nó chất rắn và chất lỏng có sự “kỵ nhau”, chúng có khuynh hướng giảm thiểu sự tiếp xúc nhau bằng việc giảm tối đa diện tích tiếp xúc giữa nước và lá sen.
Hình 1.4.3: Góc thấm ướt của nước trên thủy tinh (trái) và lá sen (phải) [30]. Hiện tướng thấm ướt và không thấm ướt có thể được đo đạc định lượng thông qua việc đo góc tiếp xúc θ:
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
Hình 1.4.4: Các trường hợp không thấm ướt, ít thấm ướt và thấm ướt tốt.
Góc tiếp xúc phụ thuộc vào tương tác bề mặt xảy ra trên 3 bề mặt: mặt phân giới giữa chất lỏng và chất khí (được đặc trưng bởi sức căng mặt ngoài lỏng-khí γlg), mặt phân giới giữa chất rắn và chất khí (được đặc trưng bởi sức căng mặt ngoài rắn-khí γsg) và mặt phân giới giữa chất rắn và chất lỏng (được đặc trưng bởi sức căng mặt ngoài rắn-lỏng γsl). Tuy nhiên, trong luận văn này tất cả các lần đo đều thực hiện với chất lỏng là nước và thực hiện trong không khí, cho nên góc tiếp xúc đo được chỉ phụ thuộc vào trạng thái bề mặt của mẫu rắn.
Hình 1.4.5: Sự phụ thuộc của góc tiếp xúc vào các dạng lực căng bề mặt.
Khi giọt lỏng nhỏ lên bề mắt rắn, tất cả chất rắn, lỏng, khí đều có khuynh hướng thu nhỏ diện tích tiếp xúc của các mặt phân giới, nhằm giảm năng lượng bề mặt rắn-lỏng, lỏng-khí, rắn-khí nhỏ nhất. Phương trình Young mô tả liên hệ giữa góc tiếp xúc và tương tác giữa 3 chất rắn-lỏng-khí:
γlgcosθ=γsg−γsl
Trong dó: γlv, γsv, γsl lần lượt là sức căng mặt ngoài của các bề mặt lỏng-khí, rắn – khí và rắn-lỏng, θ là góc tiếp. Khi bề mặt rắn được biến đổi hóa học, có thêm các nhóm chức trên bề mặt thì trang thái phân cực của bề mặt rắn thay đổi. Từ đó có thể làm thay đổi tính ái nước hoặc kỵ nước của bề mặt, tức là thay đổi góc tiếp xúc với nước. Ví dụ,
Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành
khi bề mặt vàng (Au) gắn kết các hợp chất cysteamine, glutaraldehyde, protein, … thì tính phân cực của các phần đuôi (nhóm chức tự do) sẽ quyết định góc tiếp xúc. Sau khi gắn cysteamine lên bề mặt Au, đầu SH sẽ quay vào bề mặt Au, còn đầu NH2 sẽ là đầu tự do quay ra ngoài và tương tác với nước khi đo góc tiếp xúc. Do trong nhóm NH2 thì N có độ âm điện mạnh và thu hút điện tử của 2 nguyên tử H về phía nó, nên nhóm này có tính phân cực, về phía N có nhiều điện tích âm hơn, còn 2 nguyên tử H có ít điện tích âm hơn. Do đó, NH2 có khuynh hưởng tương tác mạnh với nước cũng là phân tử phân cực, vì O có độ âm điện mạnh hút các điện tử của H. Khi đó góc tiếp xúc giữa bề mặt Au với nước sẽ giảm đi [25]. Đối với bề mặt Au sau khi gắn glutaraldehyde và protein, cũng xảy ra hiện tượng tương tự.
1.4.1.3. Phƣơng pháp phản ứng đổi màu nhờ enzim HRP
Một phương pháp nữa để đánh giá hiệu quả của quá trình biến đổi bề mặt là sử dụng phản ứng đổi màu nhờ enzim horseradish peroxidase (HRP) trong dung dịch O- dianisidine và H2O2. Phản ứng đổi màu của dung dịch chỉ xảy ra khi có mặt của enzim xúc tác là horseradish peroxidase. Như vậy, phản ứng càng mạnh khi làm lượng HRP được gắn lên GAD trên bề mặt càng lớn, chứng tỏ hiệu quả biến đổi bề mặt càng lớn.
Dung dịch phản ứng bao gồm một cặp chất oxy hoá – khử gồm o-dianisidine 1mM (đóng vai trò là chất khử) và H2O2 (là chất oxi hóa) 1mM trong đệm phosphate pH 7.4 được chuẩn bị trong cốc thuỷ tinh cả 2 chất này đều là trong suốt, không có màu trước khi thí nghiệm. O-dianisidine đóng vai trò là chất cho proton H+ và khử H2O2 thành 2 phân tử nước, phản ứng này đòi hỏi phải có sự xúc tác của enzim HRP. Sau phản ứng thì o-dianisidine cũng bị oxi hóa trở thành dạng oxi hóa, quá trình diễn ra theo sơ đồ sau: