− Quy trình biệt hóa tế bào : Theo nghiên cứu của Lee O .K. và cộng sự
(2004), các tế bào gốc trung mô có khả năng biệt hóa thành các dạng tế bào xương ,
sụn, mỡ… nếu chúng được cảm ứng trong các môi trường nuôi thích hợp [57] (theo
quy trình ở hình 2.8). Thông thường, kết quả biệt hóa sẽ được đánh giá sau 21 ngày
nuôi trong môi trường cảm ứng biệt hóa tương ứng.
Mẫu tế bào nuôi
Loại môi trường cũ
Rửa tế bào bằng HBSS
Bổsung môi trường biệt hóa, nuôi ở 37 oC, 5% CO2
Nhuộm tế bàovà kiểm tra kết quả biệt hóa
Vật liệu – Phương pháp 31
− Biệt hóa thành tế bào tạo xương
Sự tiếp xúc một thời gian dài của các tế bào gốc trung mô với một hỗn hợp môi trường nuôi có bổ sung dexamethasone, L – ascorbic acid 2 – phosphate và β – glycerol phosphate cho kết quả là sự tích tụ của calcium trong tế bào chất và chất nền ngoại bào (theo quy trình ở hình 2.8) [19], [35], [36], [37], [43]. Kết quả biệt hóa được đánh giá bằng p hương pháp nhuộm Alizarin Red S (theo quy trình ở hình
2.9).
Nguyên tắc của phương pháp nhuộm Alizarin Red S : Thuốc nhuộm
Alizarin Red S sẽ kết hợp với calcium trong tế bào chất và chất nền ngoại bào do
các tế bào tạoxương tiết ra tạo thành các mảng màu đỏ.
Đổ bỏmôi trường nuôi cũ
Cốđịnh mẫu tế bào bằng cồn 70o
Rửa với PBS hoặc nước cất (3 lần)
Bổ sung 1 – 2 giọt Alizarin Red S, ủ 30 phút
Hút bỏ thuốc nhuộm, rửa lại bằng dung dịch PBS
Quan sát tế bào dưới kính hiển vi để đánh giá kết quả
Vật liệu – Phương pháp 32
− Biệt hóa thành tế bào tạo mỡ
Các tế bào gốc trung mô có thểđược biệt hóa thành tế bào tạo mỡ bằng nhiều
phương pháp khác nhau. Hầu hết các công trình đều sử dụng phương pháp biệt hóa với các chất như dexamethasone, insulin, indomethacin và IMBX (theo quy trình ở
hình 2.8) [44], [67], [74].
Sự biệt hóa được ghi nhận khi thấy có sự xuất hiện các giọt mỡ nhỏ bằng
cách quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 200 hoặc 400 lần. Ngoài ra, các tế
bào mỡ còn được xác định dựa vào phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red O (theo quy trình ở hình 2.10).
Nguyên tắc của phương pháp nhuộm Oil Red O: Oil Red O là thuốc nhuộm lipid, nó chỉ hòa tan trong lipid , do đó làm cho các giọt mỡ chuyển thành màu đỏ.
Đổ bỏmôi trường cũ
Rửa bằng PBS
Thêm 10% formalin, ủ 5 phút
Hút bỏ formalin, bổ sung một lượng formalin mới
Vật liệu – Phương pháp 33
Ủ với isopropanol 60% trong 5 phút
Đổ bỏ isopropanol và sấy khô mẫu
Bổ sung 6 phần Oil Red O/ 4 phần nước cất 2 lần,
ủ 19 phút
Ủ với isopropanol 60% trong 5 phút
Đổ bỏ isopropanol và sấy khô mẫu
Hình 2.10. Quy trình nhuộm Oil Red O (theo hướng dẫn của Sigma)
Rửa lại bằng nước cất
Kết quả – Biện luận 34
3.1.Kết quả thu nhận mẫu mô nhung hươu
Mẫu mô nhung hươu được thu nhận tại Cơ sở chăn nuôi hươu nai Trường Thịnh, Xã Phước Tân, Huyện Long Thành, Tỉnh Đồng nai.
Tại phòng thí nghiệm, phần ngọn – vùng tăng trưởng tạo sụn – của nhung hươu được thu nhận và khử trùng. Sau đó, phần này được cắt thành những mảnh nhỏ có kích thước 2 – 4 mm2.
Hình 3.1. Phần ngọn của nhung hươu
Quá trình cắt mẫu được thực hiện trong dung dịch HBSS. Điều này giúp các tế bào nhung hươu không bị mất nước, cũng như giúp ổn định trạng thái sinh lý của tế bào.
Kết quả – Biện luận 35
Sau quá trình cắt nhỏ, kết quả thu được là những mẫu mô có kích thước 2 – 4 mm2. Một phần mẫu thu được đông lạnh (theo quy trình ở hình 2.5, mục 2.4.2) để bảo quản và sử dụng cho những thí nghiệm sau. Số lượng cryotube mô nhung hươu đông lạnh thu được là 23 cryotube, mỗi cryotube chứa khoảng 0,5 gr mô nhung hươu. Phần mẫu tươi còn lại được dùng để tách tế bào đơn và tiến hành đợt nuôi cấy thứ nhất.
Hình 3.3. Các mảnh mô nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm2
3.2.Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu
Sau khi tiến hành phân tách tế bào đơn theo quy trình ở hình 2.5 mục 2.4.2, cặn tế bào được huyền phù vào 1 ml môi trường DMEM/F12 10% FBS. Mật độ tế bào sống được xác định bằng buồng đếm hồng cầu và phương pháp nhuộm Trypan blue. Kết quả thu nhận tế bào đơn được trình bày ở bảng 3.1.
Sau khi đông lạnh một thời gian, các mẫu mô nhung hươu đông lạnh sẽđược giải đông, sau đó thực hiện quy trình phân tách và thu nhận tế bào đơn giống như đối với mẫu mô tươi để tiến hành các đợt nuôi cấy tiếp theo. Các mẫu mô đông lạnh có thứ tự từ 1 đến 3 ở bảng 3.2 được tiến hành giải đông sau 15 ngày kể từ ngày đông lạnh. Các tế bào đơn thu nhận từ các mẫu mô này được dùng cho đợt nuôi cấy thứ hai. Các mẫu mô đông lạnh có thứ tự từ 4 đến 6 ở bảng 3.2 được tiến hành giải đông sau 30 ngày kể từ ngày đông lạnh. Các tế bào đơn thu nhận từ các mẫu mô này
Kết quả – Biện luận 36
được dùng cho đợt nuôi cấy thứ ba. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô đông lạnh được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu tươi
Thứ tự mẫu Khối lượng mẫu (gr) Tình trạng Số lượng tế bào đơn, sống
1 0,5 Tươi 4,7.107
2 0,7 Tươi 5,8.107
3 0,5 Tươi 4,7.107
4 0,6 Tươi 5,0.107
5 0,7 Tươi 6,0.107
Bảng 3.2. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu đông lạnh
Thứ tự mẫu Khối lượng mẫu (gr) Tình trạng Số lượng tế bào đơn, sống
1 0,6 Đông lạnh 4,7.107 2 0,6 Đông lạnh 4,9.107 3 0,7 Đông lạnh 5,5.107 4 0,5 Đông lạnh 4,5.107 5 0,6 Đông lạnh 4,8.107 6 0,6 Đông lạnh 4,8.107
Kết sốn đôn cho đôn nhậ đượ đượ đồn mô bào mỗ ết quả – Biện Theo k ng thu nhận ng lạnh là t o thấy, sau ng lạnh khô ận được. Vậ ợc sử dụng Kết qu ợc gồm nhi ng nhất (hìn ô chứa các l Hìn 3.3.Kết qu Sau o/ml. Tiếp đ ỗi flask chứa n luận kết quả ghi n được từ c tương đươn một khoản ông làm ản ậy, các quy để phục vụ uả thu nhận iều dạng kh nh 3.4). Điề oại mô khá nh 3.4. Các uả nuôi cấy u khi thu nh đó, tế bào đ a khoảng 3 nhận được các mẫu mô ng cho nhữn ng thời gian nh hưởng nh y trình đông ụ cho các ng n tế bào đơn hác nhau (c ều này được ác nhau. tế bào đơn y sơ cấp tế hận tế bào được chia đ ml dịch hu 37 c ở bảng 3. ô nhung hư ng mẫu mô n đông lạnh hiều đến kh g lạnh, giải ghiên cứu m n ban đầu có cả các tế c giải thích n thu nhận bào nhung đơn, mật đ đều vào các uyền phù tế .1 và bảng ươu tươi và có khối lượ h ngắn (tối hả năng sốn đông và ph mà đề tài đã cho thấy cá ế bào hồng là do các tế từ mô nhun g hươu độ tế bào đư c flask T25 bào. Các fl 3.2, số lượ à các mẫu m ợng xấp xỉ đa là 30 n ng của các hân tách tế ã đặt ra. ác tế bào n cầu) và kíc ế bào thu nh ng hươu (X ược đưa về 5 dùng để n lask tế bào đ ợng tế bào mô nhung h nhau. Điều ngày), quá t tế bào đơn bào đơn nà nhung hươu ch thước kh hận từ một X100) ề khoảng 10 nuôi cấy tế được ủở 37 đơn, hươu u này trình n thu ày sẽ u thu hông khối 05 tế bào, 7 oC,
Kết quả – Biện luận 38
5% CO2. Quan sát sự thay đổi của tế bào trong các flask sau mỗi 24 giờ và ghi nhận kết quả.
Bảng 3.3. Số lượng mẫu nuôi sơ cấp
Mẫu tươi Mẫu đông lạnh Số lượng
flask T25
Ngày 0 Ngày 3 Ngày 7 Ngày 0 Ngày 3 Ngày 7 10 10 10 12 12 12
Theo kết quả ghi nhận ở bảng 3.4, tất cả mẫu nuôi sơ cấp đều thành công, không xuất hiện tượng nhiễm khuẩn trong quá trình nuôi cấy. Điều này chứng tỏ rằng mẫu sinh thiết mô nhung hươu đã được xử lý tốt và quy trình xử lý mà đề tài đưa ra là phù hợp cho nghiên cứu này.
Kết quả quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược cho thấy trạng thái của tế bào nhung hươu thay đổi dần theo thời gian nuôi cấy. Cụ thể:
Ở giai đoạn 24 giờ kể từ khi bắt đầu nuôi cấy
Kết quả – Biện luận 39
Đa phần các tế bào lắng xuống đáy flask, một số tế bào bắt đầu bám dính vào bề mặt nuôi cấy, tuy nhiên biểu hiện này chưa rõ ràng. Một số lượng nhỏ tế bào ở trạng thái lơ lửng, trôi nổi trong môi trường nuôi. Điều này có thểđược giải thích là do trạng thái sinh lý của tế bào chưa ổn định, do bịảnh hưởng từ quá trình thu nhận tế bào đơn và do chưa thích nghi được với môi trường nuôi cấy.
Ở giai đoạn 48 giờ kể từ khi bắt đầu nuôi cấy
Lúc này các tế bào đã ổn định trạng thái sinh lý và thích nghi với môi trường nuôi cấy. Tế bào đã bám dính vào bề mặt nuôi cấy.
FBS trong thành phần môi trường có tác dụng phục hồi những thương tổn của tế bào, cũng như trung hòa các enzyme còn sót lại sau quá trình phân tách và thu nhận tế bào đơn. Vì vậy, FBS là một nhân tố quan trọng giúp cho quá trình bám dính diễn ra nhanh hơn. Tuy nhiên, những tế bào bị tổn thương nghiêm trọng thì không thể phục hồi được nên vẫn còn những tế bào không bám dính được vào bề mặt nuôi cấy. Những tế bào này ở trạng thái lơ lửng và trôi nổi trong môi trường nuôi.
Kết quả – Biện luận 40
Ở giai đoạn 72 giờ kể từ khi bắt đầu nuôi cấy
Phần lớn các tế bào đều bám dính vào bề mặt nuôi cấy và đang bắt đầu tăng sinh. Các tế bào không có khả năng bám dính và tế bào chết sẽ bị loại bỏ khỏi flask nuôi cấy qua quá trình thay môi trường. Việc thay môi trường sẽ cung cấp chất dinh dưỡng mới, giúp tế bào tăng trưởng tốt hơn. Sau khi thay môi trường, quan sát dưới kính hiển vi, các tế bào bám dính có hình dạng không đồng nhất. Điều này được giải thích qua nghiên cứu của Hans J. Rolf và cộng sự tại Đại học Y, thuộc Đại học Goettingen, Đức [72]. Nghiên cứu này chỉ ra rằng việc thu nhận các tế bào tại các vùng khác nhau của nhung hươu sẽ cho ra các dạng tế bào khác nhau. Một phát hiện thú vị của Hans J. Rolf và cộng sự là ở phần mô dưới da của nhung hươu chứa nhiều tế bào có biểu hiện các đặc tính của tế bào gốc trung mô và các tế bào thu nhận từ vùng này cho hiệu quả nuôi cấy cao. Đây chính là những tế bào mục tiêu mà đề tài muốn thu nhận. Như vậy, mô nhung hươu là một tập hợp của nhiều loại mô khác nhau. Do đó, khi nuôi cấy sơ cấp, hình dạng tế bào sẽ không đồng nhất.
Hình 3.7. Tế bào nhung hươu sau 72 giờ nuôi cấy (X40)
Kết quả – Biện luận 41
Ở giai đoạn 4 ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy
Ở giai đoạn này, các tế bào đã có đủ thời gian để phục hồi và thích nghi với môi trường nuôi cấy, bắt đầu đi vào pha tăng trưởng. Các tế bào phân chia liên tục, số lượng tế bào tăng lên rất nhanh, dàn đều trên diện tích bề mặt nuôi cấy.
Hình 3.8.Tế bào nhung hươu sau 4 ngày nuôi cấy (X40)
Ở giai đoạn 10 ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy
Kết quả – Biện luận 42
Hình 3.10. Tế bào nhung hươu sau 10 ngày nuôi cấy (X40)
Sau 10 ngày nuôi cấy, bảng đánh giá tỷ lệ thành công của việc nuôi sơ cấp được thiết lập. Kết quả thu nhận được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.4. Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào thu nhận từ nhung hươu
Nguồn mẫu Số lượng flask nuôi cấy
Sau 10 ngày nuôi cấy Tỷ lệ thành
công Số lượng flask nuôi
cấy thành công
Số lượng flask bị nhiễm khuẩn
Mẫu đông lạnh 10 10 0 100%
Mẫu tươi 12 12 0 100%
Tóm lại, theo những quan sát, ghi nhận và phân tích trên, các tế bào nhung hươu có khả năng sống sót rất cao, và quy trình xử lý được đánh giá là tốt. Các flask tế bào thu nhận được sau thời gian phục hồi đã tăng sinh và phát triển mạnh, không thấy xuất hiện hiện tượng nhiễm khuẩn. Khi đã đi vào pha tăng trưởng, các tế bào
Kết quả – Biện luận 43
nhung hươu nhanh chóng bao phủ diện tích bề mặt flask nuôi cấy. Điều này chứng tỏ các tế bào nhung hươu có sức tăng trưởng cao.
Tuy nhiên, kết quả quan sát cho thấy một vấn đề là khả năng bám và trải của các tế bào nhung hươu thu nhận từ mô đông lạnh chậm hơn so với khi thu nhận từ mẫu nuôi tươi. Đây là một hiện tượng bình thường bởi vì khi ở trạng thái đông lạnh chu trình tế bào bị dừng lại nên khi tiến hành giải đông và nuôi cấy các tế bào cần có thời gian để hồi phục. Mặt khác, nhiệt độ và các tinh thểđông lạnh cũng là một nguyên nhân làm tổn thương màng tế bào, từ đó hạn chế khả năng bám dính của tế bào vào bề mặt nuôi cấy. Từđiểm khác biệt trên, có thể kết luận rằng việc thu nhận và nuôi cấy tế bào nhung hươu sẽ đạt kết quả tốt nhất nếu sử dụng mẫu mô nhung hươu tươi.
3.4.Kết quả cấy chuyền và nuôi cấy tăng sinh tế bào nhung hươu
Các tế bào nhung hươu sau khi nuôi cấy sơ cấp 10 ngày sẽ chiếm khoảng 80% – 90% diện tích bề mặt nuôi cấy của flask. Lúc này, các flask sẽ được tiến hành cấy chuyền. Việc cấy chuyền là cần thiết với mục đích cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho tế bào tiếp tục tăng sinh. Quá trình nuôi cấy dài ngày cộng với cấy chuyền nhiều lần giúp loại các tế bào trưởng thành, chỉ giữ lại những tế bào có khả năng tăng sinh dài hạn.
Ở quá trình cấy chuyền, sau khi cho Trypsin – EDTA 0,25% vào, các tế bào bắt đầu co lại, có dạng cầu và nổi lên. Các tế bào đơn được thu nhận và được chia đều vào các flask mới. Thông thường, mỗi flask có đầy tế bào sẽ được cấy chuyền thành hai flask mới.
Ở thời điểm 24 giờ sau cấy chuyền, phần lớn các tế bào nhung hươu đã bám dính trở lại bề mặt nuôi cấy. Bên cạnh các tế bào đã bám dính, một lượng nhỏ tế bào vẫn ở trạng thái trôi nổi, lơ lửng trong môi trường nuôi. Đây chính là những tế bào trưởng thành, sau một số lần phân chia nhất định chúng sẽ tựđộng chết theo chương trình đã được định sẵn. Vì vậy, cấy chuyền nhiều lần cũng là một phương pháp làm tinh sạch dần quần thể tể bào mong muốn thu nhận.
Kết quả – Biện luận 44
So với quá trình nuôi cấy sơ cấp, các tế bào nhung hươu sau cấy chuyền có khả năng bám dính và tăng sinh nhanh hơn. Điều này là do các tế bào không phải chịu tác động của enzyme trong thời gian dài như trong quá trình phân tách để thu