hóa thành tế bào tạo xương dương tính với thuốc nhuộm Alizarin Red S (X40) (A. Đối chứng, B – C. Thí nghiệm)
Như vậy, về mặt hình thái, có thể đánh giá sơ bộ là các tế bào nhung hươu đã biệt hóa thành tế bào tạo xương. Các nghiên cứu tiếp theo như: nhuộm alkaline phosphatase, khảo sát sự hiện diện các marker phân tử của tế bào xương
Kết quả – Biện luận 54
(Osteocalcin, Osteopotin…) cần được thực hiện để chứng minh rằng các tế bào nhung hươu thực sự có khả năng biệt hóa thành tế bào xương.
3.5.2.2. Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo mỡ
Các tế bào nhung hươu cũng được cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ, tương tự như cảm ứng thành tế bào tạo xương. Theo dõi sự biến đổi trạng thái của tế bào ở các giai đoạn 0 giờ, 7 ngày, 15 ngày, 20 ngày sau biệt hóa.
Ở giai đoạn 0 giờ sau khi cho môi trường cảm ứng biệt hóa vào: các tế bào chưa có sự thay đổi.
Sau 7 ngày nuôi cấy trong mơi trường biệt hóa: một số tế bào chuyển từ dạng trải dài sang trải rộng.
Sau 15 ngày ni cấy trong mơi trường biệt hóa biệt hóa: các tế bào có sự thay đổi về hình dạng, chuyển từ dạng trải dài sang dạng trải rộng và có tạo thành giọt mỡ ti li trong tế bào chất.
Sau 20 ngày biệt hóa: đa số các tế bào đã chuyển qua dạng trải rộng. Trong tế bào chất, các giọt mỡ ti li kết hợp với nhau thành các giọt mỡ lớn hơn. Đây là đặc điểm dùng để phân biệt các tế bào nhung hươu đã được biệt hóa thành tế bào tạo mỡ với các tế bào nhung hươu không được biệt hóa.
Các tế bào và các giọt mỡ có thể quan sát dễ dàng dưới kính hiển vi đảo ngược có độ phóng đại 200 lần.
Trong khi đó, các tế bào của mẫu đối chứng khơng có sự trải rộng hay tạo giọt mỡ như mẫu biệt hóa.
Tiến hành nhuộm mẫu tế bào đối chứng và mẫu tế bào biệt hóa với Oil Red O, quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược và ghi nhận sự bắt màu của mẫu nhuộm. Các tế bào ở mẫu biệt hóa bắt màu đỏ, cịn các tế bào ở mẫu đối chứng không bắt màu. Điều này chứng tỏ các tế bào nhung hươu đã tích tụ những giọt mỡ nhỏ. Trong các nghiên cứu tiếp theo, các marker phân tử của tế bào mỡ như PPARγ
Kết quả – Biện luận 55
(peroxisome – proliferating activated receptor γ, C/EBPα (CCAAT enhancer binding protein α) sẽ được khảo sát để làm rõ hơn kết quả trên.
(A) (B)
Hình 3.22. Các tế bào nhung hươu tích tụ giọt mỡ trong tế bào chất sau 15 ngày
nuôi cấy trong môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X100) (A. Đối chứng, B. Thí nghiệm)
(A) (B)
Hình 3.23. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày ni cấy trong mơi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X40)
Kết quả – Biện luận 56
Hình 3.24. Các giọt mỡ tích tụ trong tế bào chất của tế bào nhung hươu sau khi
ni cấy trong mơi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X200)
(A) (B)
Hình 3.25. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày ni cấy trong mơi trường biệt
hóa thành tế bào tạo mỡ dương tính với thuốc nhuộm Oil Red O (X40) (A. Đối chứng, B. Thí nghiệm)
Kết quả – Biện luận 57
3.6. Biện luận chung
Các tế bào đơn từ vùng mô đang tăng trưởng tạo sụn của nhung hươu được thu nhận thành công bằng quy trình phân tách và thu nhận tế bào đơn của Allen và cộng sự [14]. Vì được thu nhận từ một khối mô đang tăng trường tạo sụn nên các tế bào này là một tập hợp của nhiều loại tế bào khác nhau: tế bào hồng cầu, tế bào sụn, nguyên bào sợi, tế bào tạo sụn, các loại tế bào của mô liên kết, tế bào đầu nguồn, tế bào gốc… Sau khi nuôi cấy sơ cấp, các tế bào có khả năng bám dính và phân chia sẽ được nhân sinh khối bằng cách cấy chuyền nhiều lần. Ngồi mục đích tăng sinh khối, việc cấy chuyền nhiều lần sẽ giúp loại bỏ dần các tế bào trưởng thành, chỉ giữ lại những tế bào có khả năng tăng sinh dài hạn và khả năng tự làm mới. Và theo khảo sát của đề tài, thời gian giữa hai lần phân bào của tế bào nhung hươu bước đầu được ghi nhận là khoảng 48 giờ. Kết quả này chưa được báo cáo nào công bố.
Thông thường, một tế bào sinh dưỡng trưởng thành sẽ phân chia khoảng 40 – 60 lần, sau đó chúng đi vào chu trình chết đã được định sẵn (apoptosis). Ở đây, trong khoảng thời gian 180 ngày duy trì ni cấy liên tục, với thời gian nhân đôi là 48 giờ như kết quả khảo sát thu được thì các tế bào nhung hươu đã phân chia được khoảng 90 lần và các tế bào này vẫn cịn có khả năng tăng sinh tiếp nếu tiếp tục ni cấy. Vậy, các tế bào nhung hươu có khả năng tăng sinh dài hạn, nghĩa là ngoài khả năng phân chia chúng cịn phải có khả năng tự làm mới – đây chính là một trong những đặc tính của tế bào gốc. Bên cạnh đó, các tế bào này cũng có kiểu hình tương tự như các tế bào nhung hươu có biểu hiện tính gốc được thu nhận bởi Berg và cộng sự hay bởi Rolf và cộng sự [17], [72].
Năm 2007, Debra K. Berg và cộng sự thu nhận một quần thể tế bào từ vùng màng xương của hươu đực – vùng sẽ khởi đầu tăng trưởng để tạo sừng và họ gọi đây là tế bào AP (viết tắt từ antlerogenic periosteum). Các tác giả này cho rằng tế bào AP là những tế bào có khả năng biệt hóa thành tế bào xương và tế bào mỡ, và đây là những tế bào chịu trách nhiệm trong sự tái sinh của sừng hươu, hay nói cách khác đây là những tế bào gốc [17].
Kết quả – Biện luận 58
A. Tế bào AP (X200) [17] B. Tế bào Stro-1+
(X40) [72]
Hình 3.26. Tế bào nhung hươu thu nhận bởi Berg và cs hay bởi Rolf và cs
Hình 3.27. Tế bào nhung hươu do đề tài thu nhận (X200 và X40)
Năm 2008, Hans J. Rolf và cộng sự cũng đã tiến hành thu nhận tế bào đơn từ nhung hươu. Các tác giả này sử dụng marker Stro – 1, CD271 và CD133 – các marker đặc trưng của tế bào gốc trung mô – để phân loại tế bào. Các tế bào nhung hươu có biểu hiện Stro – 1+
, CD271+ và CD133+ được thu nhận. Sau khi cảm ứng biệt hóa các tế bào này biến đổi thành tế bào tạo xương và tạo mỡ trong môi trường
Kết quả – Biện luận 59
tương ứng. Vậy nhung hươu có chứa các tế bào dương tính với các marker của tế bào gốc trung mô và các tế bào này lại có thể biệt hóa thành các loại tế bào trung mô trưởng thành hơn (tế bào tạo xương, tế bào tạo mỡ). Do đó, các tác giả này cho rằng, nhung hươu có chứa các tế bào tiền thân trung mô – là một dạng tế bào gốc [72].
Trong phạm vi của luận văn này, chúng tơi chưa có điều kiện để trang bị các marker và hóa chất biệt hóa như các tác giả trên. Nhưng dựa theo các tài liệu tham khảo được chúng tơi tự chuẩn bị các mơi trường biệt hóa với thành phần như đã nêu ở mục 2.3.
Đối với mơi trường biệt hóa xương, nếu là tế bào gốc trung mô, sau một thời gian dài tiếp xúc với các hóa chất dexamethasone, AsAP và beta – glycerol phosphate, các tế bào này sẽ tích tụ calcium trong tế bào chất, chất nền ngoại bào và sẽ biểu hiện các marker tạo xương như sialoprotein, osteocalcin và osteonectin. Dexamethasone là một glucocorticoid steroid có khả năng kích thích hoặc ức chế sự biệt hóa thành xương của tế bào gốc trung mô phụ thuộc vào nồng độ của nó (dexamethasone với nồng độ thấp sẽ kích thích biệt hóa thành xương, ngược lại nồng độ cao sẽ kích thích biệt hóa thành mỡ). AsAP sẽ làm q trình biệt hóa thành xương thuận lợi hơn thơng qua việc tổng hợp collagen và tác động kích thích lên sự tăng trưởng của tế bào. Trong khi đó, beta – glycerol phosphate kích thích hình thành chất nền được calci hóa do sự kết hợp với các tác động của dexamethasone và AsAP. Cuối cùng, EGF sẽ giúp cho tế bào tăng trưởng tốt hơn [10], [11], [12], [13], [19], [35], [36], [37], [43], [64].
Đối với môi trường biệt hóa mỡ, với việc bổ sung dexamethasone (0,5 µM), 1 – isobutyl – 3 –methylxanthine (IBMX) (0,5 µM – 0,5mM), insulin (10 µM) và indomethacin (50 –100 µM), các tế bào gốc trung mô sẽ đi vào quá trình biệt hóa tạo mỡ. Trong hầu hết các báo cáo, nồng độ dexamethasone cho sự biệt hóa tạo mỡ của tế bào gốc trung mô cao gấp năm lần so với biệt hóa tạo xương. Dexamethasone là có tác dụng cảm ứng cho sự biệt hóa và các yếu tố bổ sung cịn lại sẽ kích thích
Kết quả – Biện luận 60
sự biệt hóa. Insuline sẽ kích thích sự thu nhận các phân tử glucose vào tế bào, tạo nguyên liệu cho các phản ứng chuyển hóa thành các giọt mỡ. IBMX là chất ức chế phosphodiesterase, nó khóa sự biến đổi cAMP thành 5’AMP. Điều này giúp điều hịa dương tính các protein kinase A, dẫn tới việc giảm sự tăng sinh tế bào và điều hịa dương tính hormone nhạy cảm lipase (HSL). HSL sẽ chuyển đổi triacyl glycerides thành glycerol và acid béo tự do, được biết như quá trình tạo mỡ. Indomethacin là ligand của PPAR (peroxisome proliferators – activated receptor), làm hoạt hóa một nhân tố phiên mã ức chế tín hiệu Wnt, cần thiết cho sự biệt hóa thành mỡ [11], [12], [13], [38], [39], [44], [57], [67], [68], [74].
(A) (X200) (B) (X200)
Hình 3.28. Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo xương của đề tài
Kết quả – Biện luận 61
(A) (X40) (B) (X40)
(C) (X100) (D) (X100)
Hình 3.29. Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ của đề tài (A, C)
Kết quả – Biện luận 62
(A) (X100) (B) (X100)
(C) (X100) (D) (X100)
Hình 3.30. Tế bào nhung hươu của đề tài (A, B) , tế bào AP ((C) [17]) và tế bào
Stro – 1+ ((D) [72]) sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ cho kết quả dương tính với nhuộm Oil Red O
Kết quả – Biện luận 63
Do điều kiện hạn chế, các xét nghiệm về mặt sinh học phân tử chưa được thực hiện. Tuy nhiên, dựa vào kết quả so sánh ở các hình 2.26, 2.27, 2.28, 2.29, 2.30, tế bào nhung hươu mà đề tài thu nhận được có kiểu hình tương đồng với các tế bào nhung hươu có tính gốc được thu nhận bởi Berg và cộng sự hay bởi Rolf và cộng sự, từ kiểu hình của các tế bào có tính gốc vừa được thu nhận đến kiểu hình các tế bào đã được cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo xương hay tế bào tạo mỡ [17], [72].
Bên cạnh đó, đây là đề tài về tế bào gốc đầu tiên nghiên cứu trên đối tượng hươu sao Việt Nam (Cervus nippon pseudaxis), một loài đặc hữu của Việt Nam. Kết quả của đề tài sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về tế bào gốc nhung hươu ở Việt Nam, cũng như vai trò của những tế bào gốc này trong cơ chế tái sinh của sừng hươu – một cơ chế thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc lĩnh vực y học phục hồi.
Tóm lại, theo kết quả khảo sát của đề tài, bước đầu thấy rằng các tế bào nhung hươu thu nhận được có khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới – và khả năng biệt hóa. Xét về kiểu hình, các tế bào này cũng tương đồng với các tế bào có tính gốc được thu nhận bởi Berg và cộng sự hay bởi Rolf và cộng sự [17], [72]. Đây là những cơ sở đầu tiên chứng minh rằng trong nhung hươu sao Việt Nam chứa các tế bào gốc. Trong các nghiên cứu tiếp theo, các marker phân tử của tế bào gốc nhung hươu như STRO – 1, CD271, CD133 sẽ được khảo sát để làm rõ hơn kết luận trên.
Kết luận – Đề nghị 64
4.1. Kết luận
Từ các kết quả đạt được, bước đầu thấyrằng, đề tài đã thu nhận được các tế bào gốc từ mô nhung hươu sao Việt Nam (Cervus nippon pseudaxis), với những kết luận cụ thể sau:
1. Thu nhận vả nuôi cấy in vitro thành công tế bào đơn từ vùng mô đang tăng trưởng của nhung hươu sao Việt Nam (Cervus nippon pseudaxis).
2. Các tế bào nhung hươu được chọc lọc qua quá trình nuôi cấy dài hạn bước đầubiểu hiện các đặc điểmcủa tế bào gốc:
− Có khả năng tự làm mới (phân bào 90 lần trong thời gian 180 ngày
nuôi cấy in vitro).
− Có khả năng biệt hóa thành các dạng tế bào trung mô trưởng thành như tế bào tạo xương hay tế bào tạo mỡ nếu được cảm ứng biệt hóa
trong các môi trường tương ứng.
3. Kết quả ban đầu cho thấy c ác tế bào nhung hươu biểu hiện đặc tính gốc có thời gian cần thiế t giữa hai lần phân bào là 48 giờ. Tuy nhiên , các
nghiên cứu sâu hơn cần được thực hiện để chứng minh cho nhận định
Kết luận – Đề nghị 65
4.2. Đề nghị
Do thời gian và kinh phí nghiên cứu có hạn , đề tài này chỉ dừng lại ở mức độ những ghi nhận bước đầu nên chưa thỏa mãn các minh chứng cuối cùng cho sự
hiện diện của các tế bào gốc trong nhung hươu sao Việt Nam. Trên cơ sở những kết quả này, chúng tôi đưa ramột số đề xuất như sau:
1. Chọn lọc tế bào gốc từ nhung hươu sao Việt Nam thông qua sự biểu hiện của các marker tế bào gốc như STRO – 1, CD271, CD133.
2. Xác định thời gian cần thiết giữa hai lần phân bào của tế bào gốc nhung hươu bằng phương pháp đánh dấu huỳnh quang tế bào.
3. Đánh giá khả năng tự làm mới của các tế bào gốc nhung hươu qua sự hiện diện của các protein như Nanog, Oct3/4, CrxOS, Sox2…
4. Đánh giá khả năng biệt hóa của các tế bào gốc nhung hươu bằng các marker phân tử (các marker phân tử cho tế bào xương như Osteocalcin , Osteopotin; các marker phân tử cho tế bào mỡnhư PPARγ, C/EBPα). 5. Khảo sát sự biểu hiện của các hoạt chất sinh học như proteoglycan,
glycosaminoglycan… trong quần thể tế bào nhung hươu nuôi cấy in vitro…
Đây cũng chính là những mục tiêu mà chúng tôi hướng đến trong các nghiên cứu tiếp theo.
Tài liệu tham khảo 66
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1] Đái Duy Ban, Đỗ Trọng Trùy và Đặng Huy Huỳnh (1993), Nghiên cứu thành phần các axit amin tự do trong nhung của hươu ni bán tự nhiên ở Ba Vì bằng các phương pháp điện di và sắc ký, Tạp chí Sinh học, 4, 26 – 27.
[2] Nguyễn Mạnh Hùng , Phó Đức Thuần và Đỗ Cơng Huỳnh (1996), Ảnh hưởng của nhung hươu (dạng lát khô) lên hoạt động thần kinh cấp cao ở chuột cống trắng, Tạp chí Dược học, 3, 16 – 17.
[3] Quan Vân Hùng (2006), Thăm dò tác dụng bổ huyết của nhung nai trên bệnh nhân ung thư, Trích Kỷ yếu các cơng trình nghiên cứu khoa học , Viện Y Dược học dân tộc Thành phố Hờ Chí Minh.
[4] Đặng Huy Huỳnh, Đặng Ngọc Cẩn, Trần Văn Đức và Phạm Trọng Ảnh (1992), Nuôi hươu sao ở Việt Nam, NXB Nghệ An, Việt Nam.
[5] Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học , Việt Nam.
[6] Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2008), Công nghệ sinh học trên người và động vật, NXB Giáo dục, Việt Nam.
[7] Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc và Trần Lê Bảo Hà (2007), Thu nhận và biệt hóa tế bào gốc trung mơ từ cuống rốn ngườ i, Tạp chí phát triển khoa học và cơng nghệ, 12, 5 – 10.
[8] Phan Kim Ngọc , Phạm Văn Phúc và Trương Định (2009), Công nghệ tế bào gốc, NXB Giáo dục, Việt Nam.
[9] Phó Đức Thuần, Đỗ Cơng Huỳnh và Vũ Ngọc Lộ (1996), Tìm hiểu tác dụng dược lý của nhung hươu sao Việt Nam dạng lát khơ, Tạp chí Dược học, 9, 21 –
Tài liệu tham khảo 67
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[10] Alhadlaq A. and Mao J.J. (2003), Tissue engineered neogenesis of human shaped mandibular condyle from rat mesenchymal stem cells, Journal of Dental
Research, 82, 951 – 956.
[11] Alhadlaq A. and Mao J.J. (2004), Mesenchymal stem cells: Isolation and therapeutics, Stem Cells and Development, 13, 436 – 448.
[12] Alhadlaq A. and Mao J.J. (2005), Tissue engineered osteochondral constructs in the shape of an articular condyle, Journal of Bone and Joint Surgery, 87, 936 – 944.
[13] Alhadlaq A., Tang M., and Mao J.J. (2005), Engineered adipose tissue from human mesenchymal stem cells maintains predefined shape and dimension: Implications in soft tissue augmentation and reconstruction, Tissue Engineering, 11, 556 – 566.
[14] Allen S.P., Maden M., and Price J.S. (2002), A role for retinoic acid in regulating the regeneration of deer antlers, Developmental Biology, 251, 409 – 423.
[15] Amizuka N., Henderson J.E., White J.H., Karaplis A.C., Goltzman D., Sasaki T., and Ozawa H. (2000), Recent Studies on the biological action of Parathyroid hormone (PTH) – related Peptide (PTHrP) and the PTH/PTHrP receptor in cartilage and bone, Histology and Histopathology, 15, 957 – 970.