2.4.1. Phương pháp thu nhận mẫu mô nhung hươu [60]
Nhung hươu được thu nhận tại Trại chăn nuôi hươu Trường Thịnh, Đồng
Nai. Sau khi bị cắt rời khỏi cơ thể con vật, nhung hươu được đặt vào hộp thu mẫu.
− Khối nhung được bảo quản lạnh trong đá gel và nhanh chóng chuyển về
phịng thí nghiệm.
− Tại phịng thí nghiệm, phần ngọn – vùng tăng trưởng tạo sụn – của nhung
được thu nhận (hình 2.3) và khử trùng để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo.
Vật liệu – Phương pháp 26
2.4.2. Thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu
Phần ngọn nhung hươu thu nhận ở mục 2.4.1 được đông lạnh một phần theo
quy trình ở hình 2.4, phần còn lại sẽ dùng để tách tế bào đơn theo quy trình ở hình 2.5. Mẫu mô nhung hươu đông lạnh sẽđược giải đông và tiến hành thu nhận tế bào
đơn để nuôi cấy giống nhưthao tác đối với mẫu mô nhung hươu tươi.
Phần ngọn nhung hươu
Cắt thành miếng nhỏcó kích thước 2 – 4 mm2
Rửa mẫu với HBSS (2 – 3 lần)
Bổsung môi trường đông lạnh (Mơi trường
DMEM/F12 có bổ sung 30% FBS và 10% DMSO)
Cho hỗn hợp vào cryotube
Đông lạnh mẫu ở -80 oC
Vật liệu – Phương pháp 27
Miếng nhỏnhung hươu có kích thước 2 – 4 mm2
Rửa mẫu với HBSS (2 – 3 lần)
Ủ mẫu với Trysin – EDTA 0,25% trong 15 phút ở 37 o
C
Rửa mẫu với HBSS (2 – 3 lần)
Mẫu được phân tách với collagen loại I 0,25% trong vòng 2
giờ (vortex mẫu sau mỗi 20 phút)
Lọc mẫu bằng màng lọc có kích thước lỗ 70 µm
Ly tâm dịch lọc (3.000 vịng/ phút, 10 phút)
Huyền phù cặn tế bào trong môi trường DMEM/F12 10% FBS
Vật liệu – Phương pháp 28
2.4.3. Nuôi cấy tế bào đơn
Tế bào đơn nhung hươu thu nhận được ở mục 2.4.2 sẽ được tiến hành nuôi cấy theo quy trình ở hình 2.6.
Đếm số lượng tế bào, đưa về mật độ 2.105 tế bào/ml
Hình 2.6. Quy trình ni cấy tế bào đơn [6]
2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào và cấy chuyền
2.4.4.1. Quy trình cấy chuyền tế bào
Khi mật độ tế bào đạt 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi cấy , quy trình cấy chuyền (hình 2.7) được thực hiện để cung cấp không gian cũng như chất dinh dưỡng cho sự tăng trưởng của tế bào.
Tế bào đạt 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi cấy
Loại bỏmôi trường nuôi cấy cũ
Tráng bề mặt nuôi cấy bằng dung dịch HBSS hai lần. Cho dịch huyền phù vào flask T25, nuôi ở 37 o
C, 5% CO2
Vật liệu – Phương pháp 29
Cho dung dịch Trypsin – EDTA 0,25% vào , ủở 37 oC, 5% CO2
Bổ sung môi trường DMEM/F12 10% FBS, huyền phù tế bào
Ly tâm dịch tế bào huyền phù (3.000 vòng/phút, 10 phút)
Loại bỏ dịch nổi, thêm môi trường DMEM/F12 10% FBS và huyền phù
Đếm tế bào và điều chỉnh về mật độ 1.104 – 1.106 tế bào/ml
Chuyển huyền phù tế bào vào flask T25, nuôi ở 37 o
C, 5% CO2
Theo dõi sự phát triển của tếbào, thay môi trường sau mỗi 48 giờ
Hình 2.7. Quy trình cấy chuyền tế bào [6]
2.4.4.2. Phương pháp xác định các chỉ số tế bào dựa trên phần mềm xCELLigence (phối hợp thực hiện với đại diện của Công ty Roche ở Việt Nam) xCELLigence (phối hợp thực hiện với đại diện của Công ty Roche ở Việt Nam)
Phần mềm xCELLLigence hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự thay đổi trạng thái sinh lý tế bào thông qua các tín hiệu điện được đo bởi các vi mạch cảm ứng khảm ở đáy một đĩa nuôi 96 giếng. Các tín hiệu này sẽ được c huyển qua một máy tính để phân tích và đánh giá kết quả.
Vật liệu – Phương pháp 30
2.4.5. Chứng minh các tế bào thu nhận từ mẫu mô nhung hươu biểu hiện đặc điểm của tế bào gốc đặc điểm của tế bào gốc
2.4.5.1. Kiểm chứng khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới
Tế bào nhung hươu được nuôi cấy dài hạn để kiểm tra số lần phân bào mà các tế bào này có thể thực hiện được trong śt thời gian nuôi cấy.
2.4.5.2. Kiểm chứng khả năng biệt hóa
− Quy trình biệt hóa tế bào : Theo nghiên cứu của Lee O .K. và cộng sự
(2004), các tế bào gớc trung mơ có khả năng biệt hóa thành các dạng tế bào xương ,
sụn, mỡ… nếu chúng được cảm ứng trong các môi trường nuôi thích hợp [57] (theo
quy trình ở hình 2.8). Thơng thường, kết quả biệt hóa sẽ được đánh giá sau 21 ngày
ni trong mơi trường cảm ứng biệt hóa tương ứng.
Mẫu tế bào ni
Loại mơi trường cũ
Rửa tế bào bằng HBSS
Bổ sung môi trường biệt hóa, ni ở 37 o
C, 5% CO2
Nhuộm tế bàovà kiểm tra kết quả biệt hóa
Vật liệu – Phương pháp 31
− Biệt hóa thành tế bào tạo xương
Sự tiếp xúc một thời gian dài của các tế bào gốc trung mô với một hỗn hợp mơi trường ni có bổ sung dexamethasone, L – ascorbic acid 2 – phosphate và β – glycerol phosphate cho kết quả là sự tích tụ của calcium trong tế bào chất và chất
nền ngoại bào (theo quy trình ở hình 2.8) [19], [35], [36], [37], [43]. Kết quả biệt hóa được đánh giá bằng p hương pháp nhuộm Alizarin Red S (theo quy trình ở hình
2.9).
Nguyên tắc của phương pháp nhuộm Alizarin Red S : Thuốc nhuộm
Alizarin Red S sẽ kết hợp với calcium trong tế bào chất và chất nền ngoại bào do
các tế bào tạo xương tiết ra tạo thành các mảng màu đỏ.
Đổ bỏmôi trường nuôi cũ
Cố định mẫu tế bào bằng cồn 70o
Rửa với PBS hoặc nước cất (3 lần)
Bổ sung 1 – 2 giọt Alizarin Red S, ủ 30 phút
Hút bỏ thuốc nhuộm, rửa lại bằng dung dịch PBS
Quan sát tế bào dưới kính hiển vi để đánh giá kết quả
Vật liệu – Phương pháp 32
− Biệt hóa thành tế bào tạo mỡ
Các tế bào gớc trung mơ có thểđược biệt hóa thành tế bào tạo mỡ bằng nhiều
phương pháp khác nhau. Hầu hết các cơng trình đều sử dụng phương pháp biệt hóa với các chất như dexamethasone, insulin, indomethacin và IMBX (theo quy trình ở hình 2.8) [44], [67], [74].
Sự biệt hóa được ghi nhận khi thấy có sự xuất hiện các giọt mỡ nhỏ bằng
cách quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 200 hoặc 400 lần. Ngồi ra, các tế
bào mỡ còn được xác định dựa vào phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red O (theo quy trình ở hình 2.10).
Nguyên tắc của phương pháp nhuộm Oil Red O: Oil Red O là th́c nhuộm lipid, nó chỉ hịa tan trong lipid , do đó làm cho các giọt mỡ chuyển thành màu đỏ.
Đổ bỏmôi trường cũ
Rửa bằng PBS
Thêm 10% formalin, ủ 5 phút
Hút bỏ formalin, bổ sung một lượng formalin mới
Vật liệu – Phương pháp 33
Ủ với isopropanol 60% trong 5 phút
Đổ bỏ isopropanol và sấy khô mẫu
Bổ sung 6 phần Oil Red O/ 4 phần nước cất 2 lần,
ủ 19 phút
Ủ với isopropanol 60% trong 5 phút
Đổ bỏ isopropanol và sấy khơ mẫu
Hình 2.10. Quy trình nḥm Oil Red O (theo hướng dẫn của Sigma)
Rửa lại bằng nước cất
Kết quả – Biện luận 34
3.1. Kết quả thu nhận mẫu mô nhung hươu
Mẫu mô nhung hươu được thu nhận tại Cơ sở chăn nuôi hươu nai Trường Thịnh, Xã Phước Tân, Huyện Long Thành, Tỉnh Đồng nai.
Tại phịng thí nghiệm, phần ngọn – vùng tăng trưởng tạo sụn – của nhung hươu được thu nhận và khử trùng. Sau đó, phần này được cắt thành những mảnh nhỏ có kích thước 2 – 4 mm2
.
Hình 3.1. Phần ngọn của nhung hươu
Quá trình cắt mẫu được thực hiện trong dung dịch HBSS. Điều này giúp các tế bào nhung hươu không bị mất nước, cũng như giúp ổn định trạng thái sinh lý của tế bào.
Kết quả – Biện luận 35
Sau quá trình cắt nhỏ, kết quả thu được là những mẫu mơ có kích thước 2 – 4 mm2. Một phần mẫu thu được đơng lạnh (theo quy trình ở hình 2.5, mục 2.4.2) để bảo quản và sử dụng cho những thí nghiệm sau. Số lượng cryotube mô nhung hươu đông lạnh thu được là 23 cryotube, mỗi cryotube chứa khoảng 0,5 gr mơ nhung hươu. Phần mẫu tươi cịn lại được dùng để tách tế bào đơn và tiến hành đợt ni cấy thứ nhất.
Hình 3.3. Các mảnh mơ nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm2
3.2. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu
Sau khi tiến hành phân tách tế bào đơn theo quy trình ở hình 2.5 mục 2.4.2, cặn tế bào được huyền phù vào 1 ml môi trường DMEM/F12 10% FBS. Mật độ tế bào sống được xác định bằng buồng đếm hồng cầu và phương pháp nhuộm Trypan blue. Kết quả thu nhận tế bào đơn được trình bày ở bảng 3.1.
Sau khi đơng lạnh một thời gian, các mẫu mô nhung hươu đông lạnh sẽ được giải đơng, sau đó thực hiện quy trình phân tách và thu nhận tế bào đơn giống như đối với mẫu mô tươi để tiến hành các đợt nuôi cấy tiếp theo. Các mẫu mơ đơng lạnh có thứ tự từ 1 đến 3 ở bảng 3.2 được tiến hành giải đông sau 15 ngày kể từ ngày đông lạnh. Các tế bào đơn thu nhận từ các mẫu mô này được dùng cho đợt nuôi cấy thứ hai. Các mẫu mơ đơng lạnh có thứ tự từ 4 đến 6 ở bảng 3.2 được tiến hành giải đông sau 30 ngày kể từ ngày đông lạnh. Các tế bào đơn thu nhận từ các mẫu mô này
Kết quả – Biện luận 36
được dùng cho đợt nuôi cấy thứ ba. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mơ đơng lạnh được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu tươi
Thứ tự mẫu Khối lượng mẫu (gr) Tình trạng Số lượng tế bào đơn, sống
1 0,5 Tươi 4,7.107
2 0,7 Tươi 5,8.107
3 0,5 Tươi 4,7.107
4 0,6 Tươi 5,0.107
5 0,7 Tươi 6,0.107
Bảng 3.2. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu đông lạnh
Thứ tự mẫu Khối lượng mẫu (gr) Tình trạng Số lượng tế bào đơn, sống
1 0,6 Đông lạnh 4,7.107 2 0,6 Đông lạnh 4,9.107 3 0,7 Đông lạnh 5,5.107 4 0,5 Đông lạnh 4,5.107 5 0,6 Đông lạnh 4,8.107 6 0,6 Đông lạnh 4,8.107
Kết sốn đôn cho đôn nhậ đượ đượ đồn mô bào mỗ ết quả – Biện Theo k ng thu nhận ng lạnh là t o thấy, sau ng lạnh khô ận được. Vậ ợc sử dụng Kết qu ợc gồm nhi ng nhất (hìn ơ chứa các l Hìn 3.3. Kết qu Sau o/ml. Tiếp đ ỗi flask chứa
n luận kết quả ghi n được từ c tương đươn một khoản ông làm ản ậy, các quy để phục vụ uả thu nhận iều dạng kh nh 3.4). Điề oại mô khá nh 3.4. Các
uả nuôi cấy
u khi thu nh đó, tế bào đ a khoảng 3 nhận được các mẫu mơ ng cho nhữn ng thời gian nh hưởng nh y trình đơng ụ cho các ng n tế bào đơn hác nhau (c ều này được ác nhau. tế bào đơn y sơ cấp tế hận tế bào được chia đ ml dịch hu 37 c ở bảng 3. ô nhung hư ng mẫu mô n đông lạnh hiều đến kh g lạnh, giải ghiên cứu m n ban đầu có cả các tế c giải thích n thu nhận bào nhung đơn, mật đ đều vào các uyền phù tế .1 và bảng ươu tươi và có khối lượ h ngắn (tối hả năng sốn đông và ph mà đề tài đã cho thấy cá ế bào hồng là do các tế từ mô nhun g hươu độ tế bào đư c flask T25 bào. Các fl 3.2, số lượ à các mẫu m ợng xấp xỉ đa là 30 n ng của các hân tách tế ã đặt ra. ác tế bào n cầu) và kíc ế bào thu nh ng hươu (X ược đưa về 5 dùng để n lask tế bào đ ợng tế bào mô nhung h nhau. Điều ngày), quá t tế bào đơn bào đơn nà nhung hươu ch thước kh hận từ một X100) ề khoảng 10 nuôi cấy tế được ủ ở 37 đơn, hươu u này trình n thu ày sẽ u thu hơng khối 05 tế bào, 7 oC,
Kết quả – Biện luận 38
5% CO2. Quan sát sự thay đổi của tế bào trong các flask sau mỗi 24 giờ và ghi nhận kết quả.
Bảng 3.3. Số lượng mẫu nuôi sơ cấp
Mẫu tươi Mẫu đông lạnh Số lượng
flask T25
Ngày 0 Ngày 3 Ngày 7 Ngày 0 Ngày 3 Ngày 7 10 10 10 12 12 12
Theo kết quả ghi nhận ở bảng 3.4, tất cả mẫu nuôi sơ cấp đều thành cơng, khơng xuất hiện tượng nhiễm khuẩn trong q trình ni cấy. Điều này chứng tỏ rằng mẫu sinh thiết mô nhung hươu đã được xử lý tốt và quy trình xử lý mà đề tài đưa ra là phù hợp cho nghiên cứu này.
Kết quả quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược cho thấy trạng thái của tế bào nhung hươu thay đổi dần theo thời gian nuôi cấy. Cụ thể:
Ở giai đoạn 24 giờ kể từ khi bắt đầu nuôi cấy
Kết quả – Biện luận 39
Đa phần các tế bào lắng xuống đáy flask, một số tế bào bắt đầu bám dính vào bề mặt ni cấy, tuy nhiên biểu hiện này chưa rõ ràng. Một số lượng nhỏ tế bào ở trạng thái lơ lửng, trôi nổi trong mơi trường ni. Điều này có thể được giải thích là do trạng thái sinh lý của tế bào chưa ổn định, do bị ảnh hưởng từ quá trình thu nhận tế bào đơn và do chưa thích nghi được với môi trường nuôi cấy.
Ở giai đoạn 48 giờ kể từ khi bắt đầu nuôi cấy
Lúc này các tế bào đã ổn định trạng thái sinh lý và thích nghi với mơi trường ni cấy. Tế bào đã bám dính vào bề mặt ni cấy.
FBS trong thành phần mơi trường có tác dụng phục hồi những thương tổn của tế bào, cũng như trung hòa các enzyme cịn sót lại sau q trình phân tách và thu nhận tế bào đơn. Vì vậy, FBS là một nhân tố quan trọng giúp cho quá trình bám dính diễn ra nhanh hơn. Tuy nhiên, những tế bào bị tổn thương nghiêm trọng thì khơng thể phục hồi được nên vẫn còn những tế bào khơng bám dính được vào bề mặt ni cấy. Những tế bào này ở trạng thái lơ lửng và trôi nổi trong môi trường nuôi.
Kết quả – Biện luận 40
Ở giai đoạn 72 giờ kể từ khi bắt đầu nuôi cấy
Phần lớn các tế bào đều bám dính vào bề mặt ni cấy và đang bắt đầu tăng sinh. Các tế bào khơng có khả năng bám dính và tế bào chết sẽ bị loại bỏ khỏi flask ni cấy qua q trình thay mơi trường. Việc thay môi trường sẽ cung cấp chất dinh dưỡng mới, giúp tế bào tăng trưởng tốt hơn. Sau khi thay mơi trường, quan sát dưới kính hiển vi, các tế bào bám dính có hình dạng khơng đồng nhất. Điều này được giải thích qua nghiên cứu của Hans J. Rolf và cộng sự tại Đại học Y, thuộc Đại học Goettingen, Đức [72]. Nghiên cứu này chỉ ra rằng việc thu nhận các tế bào tại các vùng khác nhau của nhung hươu sẽ cho ra các dạng tế bào khác nhau. Một phát hiện thú vị của Hans J. Rolf và cộng sự là ở phần mô dưới da của nhung hươu chứa nhiều tế bào có biểu hiện các đặc tính của tế bào gốc trung mô và các tế bào thu nhận từ vùng này cho hiệu quả ni cấy cao. Đây chính là những tế bào mục tiêu mà đề tài muốn thu nhận. Như vậy, mô nhung hươu là một tập hợp của nhiều loại mơ khác nhau. Do đó, khi ni cấy sơ cấp, hình dạng tế bào sẽ khơng đồng nhất.
Hình 3.7. Tế bào nhung hươu sau 72 giờ nuôi cấy (X40)