Tiến trình nghiên cứu

Hình 2.1. Sơ đồ mô tả các nội dung nghiên cứu

Mô nhung hươu tươi

Đông lạnh

Giải đông Thu nhận tế bào đơn

Xác định tính gốc của tế bào nhung hươu

1. Thu nhận tế bào đơn

2. Nuôi sơ cấp

3. Cấy chuyền tăng sinh

Phân tích dựa trên kiểu hình Phân tích dựa trên khả năng tăng sinh Phân tích dựa trên khả năng biệt hóa

Vật liệu – Phương pháp 20

Hình 2.2. Mẫu mô nhung hươu sao 2.2.Dụng cụ và thiết bị

Bảng 2.1. Danh mục các dụng cụ sử dụng trong đề tài

Tên dụng cụ Hãng sản xuất Mã hàng

Đĩa nuôi cấy tế bào 12 giếng Corning 3512

Đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng Corning 3596

Flask nuôi cấy tế bào T25 Corning 430168

Màng lọc tế bào 70 µm BD Biosciences 352350

Ống đông lạnh Nunc 377267

Vật liệu – Phương pháp 21

Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài

Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã thiết bị

Bểổn nhiệt Memmert WB10

Kính hiển vi quang học Zeiss PRIMO STAR

Kính hiển vi đảo ngược Olympus CKX41SF

Máy hấp khử trùng Hirayama HVA – 110

Máy ly tâm Hermle Z36HK

Máy vortex Labnet VX100

Tủ -80 oC Sanyo MDF – 192

Tủ lạnh Sanyo SR – F66NH

Tủ nuôi cấy tế bào Nuaire NU – 5500

Tủ thao tác vô trùng Nuaire NU – 426 – 400

2.3.Hóa chất

Bảng 2.3. Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài

Tên hóa chất Hãng sản xuất Mã hàng

β – glycerol phosphate Sigma 50020

Vật liệu – Phương pháp 22

Alizarin Red S Sigma A5533

Antibiotic – antimycotic Sigma A5955

Collagenase Sigma C0130

Dexamethasone Sigma D8893

Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 317275

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s Nutrient Mixture F12

Sigma D8900

Epidermal growth factor (EGF) Sigma E9644

Formalin Merck 104003

Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco 14185 – 052

Huyết thanh thanh bò (FBS) Gibco 10082 – 139

Indomethacin Sigma I7378

Insuline Sigma I6634

Isopropanol Merck 100994

L – ascorbic acid 2 – phosphate (AsAP) Sigma 49752

Oil Red O Sigma O0625

Sodium bicarbonate Sigma S5761

Trypan Blue Sigma T6146

Vật liệu – Phương pháp 23

Công thức pha trộn các hóa chất sử dụng trong đề tài:

− Dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline)

NaCl 8 gr

KCl 0,2 gr

KH2PO4 0,2 gr

Na2HPO4.7H2O 2,16 gr

Nước cất hai lần bổ sung vừa đủ 1.000 ml

Tổng thể tích 1.000 ml

Chuẩn pH 7,4, hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong vòng 30 phút.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng, sử dụng tối đa trong 1 tháng.

− Môi trường DMEM/F12

DMEM/F12 dạng bột 15,6 gr

NaHCO3 1,2 gr

Nước cất hai lần bổ sung vừa đủ 1.000 ml

Tổng thể tích 1.000 ml

Chuẩn pH 7,4; lọc vô trùng bằng màng lọc 0,2 µm. Bảo quản lạnh ở 4 oC, sử

dụng tối đa trong ba tuần.

− Môi trường DMEM/F12 bổ sung 10% FBS

FBS 10 ml

DMEM/F12 90 ml

Tổng thể tích 100 ml

Vật liệu – Phương pháp 24

− Môi trường biệt hóa mỡ

100 ml môi trường DMEM/F12 bổ sung 10% FBS và bổ sung thêm: 3 – isobutyl – 1 – methylxanthine 0,5 µM

Dexamethasone 0,5 µM

Insuline 10 µM

Indomethacin 60 µM

− Môi trường biệt hóa xương

100 ml môi trường DMEM/F12 bổ sung 10% FBS và bổ sung thêm:

Dexamethasone 0,1 µM

β – glycerol phosphate 10 mM

L – ascorbic aid 2 – phospate 50 mM

EGF 10 µM

− Công thức pha thuốc nhuộm Alizarin Red Solution

Alizarin Red 2 gr

Nước cất hai lần đủ 100 ml

Tổng thể tích 100 ml

Trộn đều, chuẩn pH 4,1 – 4,3 với NH4Cl 10%.

− Công thức pha thuốc nhuộm Oil Red Solution

Oil Red 0,5 gr

Isopropanol 100 ml

Tổng thể tích 100 ml

Đặt vào bể ổn nhiệt (37 oC) và lắc đều trong 10 phút. Sau đó, lọc lại bằng giấy lọc Whatman.

Vật liệu – Phương pháp 25

− Môi trường đông lạnh

DMSO 10 ml

Huyết thanh FBS 30 ml

DMEM/F12 60 ml

Tổng thể tích 100 ml

Lọc vô trùng bằng màng lọc 0,2 µm, bảo quản ở 4 oC.

− Collagenase 0,25%

Collagenase 0,25 gr

HBSS 100 ml

Tổng thể tích 100 ml

Lọc vô trùng bằng màng lọc 0,2 µm, bảo quản ở 4 oC.

2.4.Các phương pháp thực nghiệm

2.4.1. Phương pháp thu nhận mẫu mô nhung hươu [60]

Nhung hươu được thu nhận tại Trại chăn nuôi hươu Trường Thịnh, Đồng Nai. Sau khi bị cắt rời khỏi cơ thể con vật, nhung hươu được đặt vào hộp thu mẫu.

− Khối nhung được bảo quản lạnh trong đá gel và nhanh chóng chuyển về

phòng thí nghiệm.

− Tại phòng thí nghiệm, phần ngọn – vùng tăng trưởng tạo sụn – của nhung

được thu nhận (hình 2.3) và khử trùng để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo.

Vật liệu – Phương pháp 26

2.4.2. Thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu

Phần ngọn nhung hươu thu nhận ở mục 2.4.1 được đông lạnh một phần theo

quy trình ở hình 2.4, phần còn lại sẽ dùng để tách tếbào đơn theo quy trình ở hình

2.5. Mẫu mô nhung hươu đông lạnh sẽđược giải đông và tiến hành thu nhận tế bào

đơn để nuôi cấy giống nhưthao tác đối với mẫu mô nhung hươu tươi.

Phần ngọn nhung hươu

Cắt thành miếng nhỏcó kích thước 2 – 4 mm2

Rửa mẫu với HBSS (2 – 3 lần)

Bổsung môi trường đông lạnh (Môi trường

DMEM/F12 có bổ sung 30% FBS và 10% DMSO)

Cho hỗn hợp vào cryotube

Đông lạnh mẫu ở -80 oC

Vật liệu – Phương pháp 27

Miếng nhỏnhung hươu có kích thước 2 – 4 mm2

Rửa mẫu với HBSS (2 – 3 lần)

Ủ mẫu với Trysin – EDTA 0,25% trong 15 phút ở 37 oC

Rửa mẫu với HBSS (2 – 3 lần)

Mẫu được phân tách với collagen loại I 0,25% trong vòng 2

giờ (vortex mẫu sau mỗi 20 phút)

Lọc mẫu bằng màng lọc có kích thước lỗ 70 µm

Ly tâm dịch lọc (3.000 vòng/ phút, 10 phút)

Huyền phù cặn tế bào trong môi trường DMEM/F12 10% FBS

Vật liệu – Phương pháp 28

2.4.3. Nuôi cấy tế bào đơn

Tế bào đơn nhung hươu thu nhận được ở mục 2.4.2 sẽ được tiến hành nuôi cấy theo quy trình ở hình 2.6.

Đếm sốlượng tếbào, đưa về mật độ 2.105 tế bào/ml

Hình 2.6. Quy trình nuôi cấy tế bào đơn [6]

2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào và cấy chuyền

2.4.4.1. Quy trình cấy chuyền tế bào

Khi mật độ tế bào đạt 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi cấy , quy trình cấy chuyền (hình 2.7) được thực hiện để cung cấp không gian cũng như chất dinh dưỡng cho sự tăng trưởng của tế bào.

Tế bào đạt 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi cấy

Loại bỏmôi trường nuôi cấy cũ

Tráng bề mặt nuôi cấy bằng dung dịch HBSS hai lần. Cho dịch huyền phù vào flask T25, nuôi ở 37 oC, 5% CO2

Vật liệu – Phương pháp 29

Cho dung dịch Trypsin – EDTA 0,25% vào , ủở 37 oC, 5% CO2

Bổ sung môi trường DMEM/F12 10% FBS, huyền phù tế bào

Ly tâm dịch tế bào huyền phù (3.000 vòng/phút, 10 phút)

Loại bỏ dịch nổi, thêm môi trường DMEM/F12 10% FBS và huyền phù

Đếm tế bào và điều chỉnh về mật độ 1.104 – 1.106 tế bào/ml

Chuyển huyền phù tế bào vào flask T25, nuôi ở 37 oC, 5% CO2

Theo dõi sự phát triển của tếbào, thay môi trường sau mỗi 48 giờ

Hình 2.7. Quy trình cấy chuyền tế bào [6]

2.4.4.2. Phương pháp xác định các chỉ số tế bào dựa trên phần mềm xCELLigence (phối hợp thực hiện với đại diện của Công ty Roche ở Việt Nam) xCELLigence (phối hợp thực hiện với đại diện của Công ty Roche ở Việt Nam)

Phần mềm xCELLLigence hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự thay đổi trạng thái sinh lý tế bào thông qua các tín hiệu điện được đo bởi các vi mạch cảm ứng khảm ở đáy một đĩa nuôi 96 giếng. Các tín hiệu này sẽ được c huyển qua một máy tính để phân tích và đánh giá kết quả.

Vật liệu – Phương pháp 30

2.4.5. Chứng minh các tế bào thu nhận từ mẫu mô nhung hươu biểu hiện đặc điểm của tế bào gốc đặc điểm của tế bào gốc

2.4.5.1. Kiểm chứng khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới

Tế bào nhung hươu được nuôi cấy dài hạn để kiểm tra số lần phân bào mà các tế bào này có thể thực hiện được trong suốt thời gian nuôi cấy.

2.4.5.2. Kiểm chứng khả năng biệt hóa

− Quy trình biệt hóa tế bào : Theo nghiên cứu của Lee O .K. và cộng sự

(2004), các tế bào gốc trung mô có khả năng biệt hóa thành các dạng tế bào xương ,

sụn, mỡ… nếu chúng được cảm ứng trong các môi trường nuôi thích hợp [57] (theo

quy trình ở hình 2.8). Thông thường, kết quả biệt hóa sẽ được đánh giá sau 21 ngày

nuôi trong môi trường cảm ứng biệt hóa tương ứng.

Mẫu tế bào nuôi

Loại môi trường cũ

Rửa tế bào bằng HBSS

Bổsung môi trường biệt hóa, nuôi ở 37 oC, 5% CO2

Nhuộm tế bàovà kiểm tra kết quả biệt hóa

Vật liệu – Phương pháp 31

− Biệt hóa thành tế bào tạo xương

Sự tiếp xúc một thời gian dài của các tế bào gốc trung mô với một hỗn hợp môi trường nuôi có bổ sung dexamethasone, L – ascorbic acid 2 – phosphate và β – glycerol phosphate cho kết quả là sự tích tụ của calcium trong tế bào chất và chất nền ngoại bào (theo quy trình ở hình 2.8) [19], [35], [36], [37], [43]. Kết quả biệt hóa được đánh giá bằng p hương pháp nhuộm Alizarin Red S (theo quy trình ở hình

2.9).

Nguyên tắc của phương pháp nhuộm Alizarin Red S : Thuốc nhuộm

Alizarin Red S sẽ kết hợp với calcium trong tế bào chất và chất nền ngoại bào do

các tế bào tạoxương tiết ra tạo thành các mảng màu đỏ.

Đổ bỏmôi trường nuôi cũ

Cốđịnh mẫu tế bào bằng cồn 70o

Rửa với PBS hoặc nước cất (3 lần)

Bổ sung 1 – 2 giọt Alizarin Red S, ủ 30 phút

Hút bỏ thuốc nhuộm, rửa lại bằng dung dịch PBS

Quan sát tế bào dưới kính hiển vi để đánh giá kết quả

Vật liệu – Phương pháp 32

− Biệt hóa thành tế bào tạo mỡ

Các tế bào gốc trung mô có thểđược biệt hóa thành tế bào tạo mỡ bằng nhiều

phương pháp khác nhau. Hầu hết các công trình đều sử dụng phương pháp biệt hóa với các chất như dexamethasone, insulin, indomethacin và IMBX (theo quy trình ở

hình 2.8) [44], [67], [74].

Sự biệt hóa được ghi nhận khi thấy có sự xuất hiện các giọt mỡ nhỏ bằng

cách quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 200 hoặc 400 lần. Ngoài ra, các tế

bào mỡ còn được xác định dựa vào phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red O (theo quy trình ở hình 2.10).

Nguyên tắc của phương pháp nhuộm Oil Red O: Oil Red O là thuốc nhuộm lipid, nó chỉ hòa tan trong lipid , do đó làm cho các giọt mỡ chuyển thành màu đỏ.

Đổ bỏmôi trường cũ

Rửa bằng PBS

Thêm 10% formalin, ủ 5 phút

Hút bỏ formalin, bổ sung một lượng formalin mới

Vật liệu – Phương pháp 33

Ủ với isopropanol 60% trong 5 phút

Đổ bỏ isopropanol và sấy khô mẫu

Bổ sung 6 phần Oil Red O/ 4 phần nước cất 2 lần,

ủ 19 phút

Ủ với isopropanol 60% trong 5 phút

Đổ bỏ isopropanol và sấy khô mẫu

Hình 2.10. Quy trình nhuộm Oil Red O (theo hướng dẫn của Sigma)

Rửa lại bằng nước cất

Kết quả – Biện luận 34

3.1.Kết quả thu nhận mẫu mô nhung hươu

Mẫu mô nhung hươu được thu nhận tại Cơ sở chăn nuôi hươu nai Trường Thịnh, Xã Phước Tân, Huyện Long Thành, Tỉnh Đồng nai.

Tại phòng thí nghiệm, phần ngọn – vùng tăng trưởng tạo sụn – của nhung hươu được thu nhận và khử trùng. Sau đó, phần này được cắt thành những mảnh nhỏ có kích thước 2 – 4 mm2.

Hình 3.1. Phần ngọn của nhung hươu

Quá trình cắt mẫu được thực hiện trong dung dịch HBSS. Điều này giúp các tế bào nhung hươu không bị mất nước, cũng như giúp ổn định trạng thái sinh lý của tế bào.

Kết quả – Biện luận 35

Sau quá trình cắt nhỏ, kết quả thu được là những mẫu mô có kích thước 2 – 4 mm2. Một phần mẫu thu được đông lạnh (theo quy trình ở hình 2.5, mục 2.4.2) để bảo quản và sử dụng cho những thí nghiệm sau. Số lượng cryotube mô nhung hươu đông lạnh thu được là 23 cryotube, mỗi cryotube chứa khoảng 0,5 gr mô nhung hươu. Phần mẫu tươi còn lại được dùng để tách tế bào đơn và tiến hành đợt nuôi cấy thứ nhất.

Hình 3.3. Các mảnh mô nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm2

3.2.Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu

Sau khi tiến hành phân tách tế bào đơn theo quy trình ở hình 2.5 mục 2.4.2, cặn tế bào được huyền phù vào 1 ml môi trường DMEM/F12 10% FBS. Mật độ tế bào sống được xác định bằng buồng đếm hồng cầu và phương pháp nhuộm Trypan blue. Kết quả thu nhận tế bào đơn được trình bày ở bảng 3.1.

Sau khi đông lạnh một thời gian, các mẫu mô nhung hươu đông lạnh sẽđược giải đông, sau đó thực hiện quy trình phân tách và thu nhận tế bào đơn giống như đối với mẫu mô tươi để tiến hành các đợt nuôi cấy tiếp theo. Các mẫu mô đông lạnh có thứ tự từ 1 đến 3 ở bảng 3.2 được tiến hành giải đông sau 15 ngày kể từ ngày đông lạnh. Các tế bào đơn thu nhận từ các mẫu mô này được dùng cho đợt nuôi cấy thứ hai. Các mẫu mô đông lạnh có thứ tự từ 4 đến 6 ở bảng 3.2 được tiến hành giải đông sau 30 ngày kể từ ngày đông lạnh. Các tế bào đơn thu nhận từ các mẫu mô này

Kết quả – Biện luận 36

được dùng cho đợt nuôi cấy thứ ba. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô đông lạnh được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.1. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu tươi

Thứ tự mẫu Khối lượng mẫu (gr) Tình trạng Số lượng tế bào đơn, sống

1 0,5 Tươi 4,7.107

2 0,7 Tươi 5,8.107

3 0,5 Tươi 4,7.107

4 0,6 Tươi 5,0.107

5 0,7 Tươi 6,0.107

Bảng 3.2. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu đông lạnh

Thứ tự mẫu Khối lượng mẫu (gr) Tình trạng Số lượng tế bào đơn, sống

1 0,6 Đông lạnh 4,7.107 2 0,6 Đông lạnh 4,9.107 3 0,7 Đông lạnh 5,5.107 4 0,5 Đông lạnh 4,5.107 5 0,6 Đông lạnh 4,8.107 6 0,6 Đông lạnh 4,8.107

Kết sốn đôn cho đôn nhậ đượ đượ đồn mô bào mỗ ết quả – Biện Theo k ng thu nhận ng lạnh là t o thấy, sau ng lạnh khô ận được. Vậ ợc sử dụng Kết qu ợc gồm nhi ng nhất (hìn ô chứa các l Hìn 3.3.Kết qu Sau o/ml. Tiếp đ ỗi flask chứa n luận kết quả ghi n được từ c tương đươn một khoản ông làm ản ậy, các quy để phục vụ uả thu nhận iều dạng kh nh 3.4). Điề oại mô khá nh 3.4. Các uả nuôi cấy u khi thu nh đó, tế bào đ a khoảng 3 nhận được các mẫu mô ng cho nhữn ng thời gian nh hưởng nh y trình đông ụ cho các ng n tế bào đơn hác nhau (c ều này được ác nhau. tế bào đơn y sơ cấp tế hận tế bào được chia đ ml dịch hu 37 c ở bảng 3. ô nhung hư ng mẫu mô n đông lạnh hiều đến kh g lạnh, giải ghiên cứu m n ban đầu có cả các tế c giải thích n thu nhận bào nhung đơn, mật đ đều vào các uyền phù tế .1 và bảng ươu tươi và có khối lượ h ngắn (tối hả năng sốn đông và ph mà đề tài đã cho thấy cá ế bào hồng là do các tế từ mô nhun g hươu độ tế bào đư c flask T25 bào. Các fl 3.2, số lượ à các mẫu m