Hình 3.13. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền ngày 7 (cấy chuyền lần 1)
Kết quả – Biện luận 46
Hình 3.14. Tế bào nhung hươu qua 2 lần cấy chuyền (X40)
Sau khoảng 3 lần cấy chuyền, hình dạng tế bào nhung hươu tương đối đồng nhất.
Kết quả – Biện luận 47
Hình 3.16. Tế bào nhung hươu qua 4 lần cấy chuyền (X40)
Hình 3.17. Tế bào nhung hươu qua 5 lần cấy chuyền (X100)
Để theo dõi sự tăng sinh của tế bào, các bước sau được tiến hành: lựa chọn flask tế bào (lượng tế bào đạt 70 – 80% diện tích bề mặt ni cấy), tách bằng Trypsin – EDTA 0,25%, ly tâm thu cặn và huyền phù tế bào với môi trường nuôi; dịch huyền phù tế bào được cho vào đĩa 24 giếng với mật độ ban đầu là 5.105 tế bào/ml, mỗi giếng 1 ml; sau mỗi 48 giờ, tách tế bào từ 3 giếng của đĩa và tiến hành xác định lại mật độ bằng buồng đếm hồng cầu; ghi nhận mật độ tế bào trung bình; sự thay đổi mật độ tế bào qua 10 ngày ni cấy được trình bày ở bảng 3.6.
Kết Đĩa Đĩa Đĩa bào ghi ết quả – Biện Ngày a 1 5,0.10 a 2 5,0.10 a 3 5,0.10 Số liệu Số liệu o nhung hư i nhận, số lư 0 20 40 60 80 100 120 140 160 M ậ t độ t ế bà o x 10 00 00 n luận Bảng 3.5 y 0 Ngày 05 9,7.1 05 9,1.1 05 9,4.1 u ở bảng 3.6 Đồ thị 3. u ở bảng 3.6 ươu qua các ượng tế bào Ngày 0 5. Kết quả n Mật độ t y 2 Ng 105 18,2 105 17,5 105 18, 6 được hình .1. Sự tăng 6 và đồ thị c ngày nuôi o sẽ tăng lên Ngày 2 N 48 nuôi tăng s tế bào trung gày 4 N 2.105 3 5.105 3 1.105 3 ảnh hóa th trưởng của 3.1 cho thấ i cấy là tươ n gấp đơi sa Ngày 4 Ngà sinh tế bào g bình (tế bà Ngày 6 36,0.105 35,8.105 36,1.105 ành đồ thị 3 a tế bào nh
ấy, sự gia tă ơng đối đồn au mỗi 48 g ày 6 Ngày nhung hươ ào/ml) Ngày 8 72,4. 105 71,9.105 72,2.105 3.1. hung hươu ăng về mặt ng đều. The giờ. 8 Ngày 10 ơu Ngày 144,2. 143,6. 144,1. số lượng củ eo kết quả đ Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3 10 105 105 105 ủa tế được 1 2 3
Kết quả – Biện luận 49
Bên cạnh đó, theo kết quả được ghi nhận và phân tích của phần mềm xCELLLigence, sự thay đổi điện thế của tế bào được trình bày như ở đồ thị 3.2.
Đồ thị 3.2. Đường cong tăng trưởng của tế bào nhung hươu dựa trên sự thay đổi
điện thế (theo phần mềm xCELLigence)
Trong đó:
Mật độ tế bào ban đầu là 50.000 tế bào/ml Mật độ tế bào ban đầu là 25.000 tế bào/ml Mật độ tế bào ban đầu là 12.500 tế bào/ml Mật độ tế bào ban đầu là 6.250 tế bào/ml Mật độ tế bào ban đầu là 3.125 tế bào/ml Mật độ tế bào ban đầu là 1.562 tế bào/ml
Kết quả – Biện luận 50
Kết quả phân tích ở đồ thị 3.2 cho thấy sự thay đổi tín hiệu điện của tế bào nhung hươu là tịnh tiến đều qua các ngày nuôi cấy. Qua đường biểu diễn số liệu cho các giếng có mật độ tế bào ban đầu là 50.000 tế bào/ml có thể đưa ra nhận xét như sau: ở giai đoạn 24 giờ sau khi cho tế bào vào đĩa 96 giếng, khi các tế bào đã bám dính hồn tồn vào bề mặt ni cấy (suy luận theo kết quả ghi nhận được qua các lần cấy chuyền trước) thì chỉ số tế bào ở vào khoảng 2. Sau 72 giờ nuôi cấy, chỉ số tế bào ở khoảng 4. Vậy, thời gian để chỉ số tế bào tăng gấp đôi là khoảng 48 giờ. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả ghi nhận được qua các lần cấy chuyền ở các thí nghiệm trước.
Hai kết quả trên bước đầu cho thấy các tế bào nhung hươu có thời gian nhân đơi quần thể là vào khoảng 48 giờ. Các nghiên cứu sâu hơn cần được thực hiện để làm rõ kết quả ghi nhận ở trên, chẳng hạn: các tế bào nhung hươu có thể được đánh dấu huỳnh quang và sự thay đổi về mặt số lượng của các tế bào đã đánh dấu huỳnh quan sẽ được theo dõi trong suốt q trình ni cấy để từ đó xác định chính xác thời gian giữa hai lần phân bào…
3.5. Kết quả chứng minh tính gốc của các tế bào thu nhận được từ mẫu mô nhung hươu
3.5.1. Khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới
Trong thí nghiệm này, bên cạnh việc nuôi cấy tăng sinh tế bào để phục vụ cho các thí nghiệm như đơng lạnh hay biệt hóa, một flask tế bào nhung hươu được duy trì ni cấy và cấy chuyền liên tục từ ngày 01/ 12/ 2009 đến ngày 30/ 05/ 2010. Theo đó, tổng thời gian nuôi cấy là khoảng 180 ngày. Đối chiếu với thời gian cần thiết giữa hai lần phân bào (48 giờ) như đã tính tốn ở trên, tế bào nhung hươu đã phân chia được khoảng 90 lần. Theo kết quả quan sát, các tế bào này vẫn còn khả năng phân chia nếu được tiếp tục nuôi cấy. Vậy các tế bào nhung hươu thu nhận được có khả năng tăng sinh dài hạn trong điều kiện nuôi cấy in vitro – điều này bước đầu chứng tỏ rằng các tế bào nhung hươu thu được phải có khả năng tự làm mới. Để kết luận trên thuyết phục hơn, sự hiện diện của các protein duy trì khả năng
Kết quả – Biện luận 51
tự làm mới như Nanog, Oct3/4, CrxOS, Sox2… cần được khảo sát. Và những kết quả này sẽ được bổ sung trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.2. Khả năng biệt hóa
3.5.2.1. Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo xương
Hình 3.18. Các tế bào nhung hươu trước khi bắt đầu cảm ứng biệt hóa (X40)
Sau khi mơi trường biệt hóa được cho vào các giếng nuôi, trạng thái của tế bào được theo dõi vào ngày biệt hóa thứ 0, 7, 15, 20:
Ở giai đoạn 0 ngày sau biệt hóa: các tế bào khơng có sự thay đổi về hình dạng.
Ở giai đoạn 7 ngày sau biệt hóa: các tế bào bắt đầu co lại, bắt đầu quá trình chuyển sang dạng hình trịn, hình dạng đặc trưng của tế bào tạo xương. Ở giai đoạn 15 ngày sau biệt hóa: đa số các tế bào đã chuyển sang hình dạng
trịn và bên trong tế bào bắt đầu có sự phân khoang, đây là dấu hiệu của sự khống hóa tế bào.
Ở giai đoạn 20 ngày sau biệt hóa: các tế bào có hình thái giống tế bào tạo xương ni cấy in vitro, có sự tích tụ calcium trong tế bào chất cũng như có hiện tượng khống hóa ở chất nền ngoại bào.
Kết quả – Biện luận 52
Trong khi đó, mẫu đối chứng vẫn giữ ngun hình dạng, khơng có dấu hiệu tích tụ calcium trong tế bào.
(A) Đối chứng (B) Thí nghiệm
Hình 3.19. Các tế bào nhung hươu sau 15 ngày nuôi cấy trong mơi trường biệt
hóa thành tế bào tạo xương (X200)
(A) Đối chứng (B) Thí nghiệm
Hình 3.20. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy trong môi trường biệt
Kết quả – Biện luận 53
Tiến hành nhuộm mẫu tế bào đối chứng và mẫu tế bào biệt hóa với Alizarin Red S, quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược và ghi nhận sự bắt màu của mẫu nhuộm. Các tế bào ở mẫu được cảm ứng biệt hóa bắt màu đỏ, cịn các tế bào ở mẫu đối chứng khơng bắt màu. Điều này chứng tỏ các tế bào nhung hươu đã có sự lắng tụ ion calcium trong tế bào chất cũng như trong chất nền ngoại bào.
(A)
(B) (C)
Hình 3.21. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày ni cấy trong mơi trường biệt
hóa thành tế bào tạo xương dương tính với thuốc nhuộm Alizarin Red S (X40) (A. Đối chứng, B – C. Thí nghiệm)
Như vậy, về mặt hình thái, có thể đánh giá sơ bộ là các tế bào nhung hươu đã biệt hóa thành tế bào tạo xương. Các nghiên cứu tiếp theo như: nhuộm alkaline phosphatase, khảo sát sự hiện diện các marker phân tử của tế bào xương
Kết quả – Biện luận 54
(Osteocalcin, Osteopotin…) cần được thực hiện để chứng minh rằng các tế bào nhung hươu thực sự có khả năng biệt hóa thành tế bào xương.
3.5.2.2. Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo mỡ
Các tế bào nhung hươu cũng được cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ, tương tự như cảm ứng thành tế bào tạo xương. Theo dõi sự biến đổi trạng thái của tế bào ở các giai đoạn 0 giờ, 7 ngày, 15 ngày, 20 ngày sau biệt hóa.
Ở giai đoạn 0 giờ sau khi cho môi trường cảm ứng biệt hóa vào: các tế bào chưa có sự thay đổi.
Sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường biệt hóa: một số tế bào chuyển từ dạng trải dài sang trải rộng.
Sau 15 ngày ni cấy trong mơi trường biệt hóa biệt hóa: các tế bào có sự thay đổi về hình dạng, chuyển từ dạng trải dài sang dạng trải rộng và có tạo thành giọt mỡ ti li trong tế bào chất.
Sau 20 ngày biệt hóa: đa số các tế bào đã chuyển qua dạng trải rộng. Trong tế bào chất, các giọt mỡ ti li kết hợp với nhau thành các giọt mỡ lớn hơn. Đây là đặc điểm dùng để phân biệt các tế bào nhung hươu đã được biệt hóa thành tế bào tạo mỡ với các tế bào nhung hươu khơng được biệt hóa.
Các tế bào và các giọt mỡ có thể quan sát dễ dàng dưới kính hiển vi đảo ngược có độ phóng đại 200 lần.
Trong khi đó, các tế bào của mẫu đối chứng khơng có sự trải rộng hay tạo giọt mỡ như mẫu biệt hóa.
Tiến hành nhuộm mẫu tế bào đối chứng và mẫu tế bào biệt hóa với Oil Red O, quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược và ghi nhận sự bắt màu của mẫu nhuộm. Các tế bào ở mẫu biệt hóa bắt màu đỏ, cịn các tế bào ở mẫu đối chứng không bắt màu. Điều này chứng tỏ các tế bào nhung hươu đã tích tụ những giọt mỡ nhỏ. Trong các nghiên cứu tiếp theo, các marker phân tử của tế bào mỡ như PPARγ
Kết quả – Biện luận 55
(peroxisome – proliferating activated receptor γ, C/EBPα (CCAAT enhancer binding protein α) sẽ được khảo sát để làm rõ hơn kết quả trên.
(A) (B)
Hình 3.22. Các tế bào nhung hươu tích tụ giọt mỡ trong tế bào chất sau 15 ngày
nuôi cấy trong môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X100) (A. Đối chứng, B. Thí nghiệm)
(A) (B)
Hình 3.23. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày ni cấy trong mơi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X40)
Kết quả – Biện luận 56
Hình 3.24. Các giọt mỡ tích tụ trong tế bào chất của tế bào nhung hươu sau khi
ni cấy trong mơi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X200)
(A) (B)
Hình 3.25. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy trong mơi trường biệt
hóa thành tế bào tạo mỡ dương tính với thuốc nhuộm Oil Red O (X40) (A. Đối chứng, B. Thí nghiệm)
Kết quả – Biện luận 57
3.6. Biện luận chung
Các tế bào đơn từ vùng mô đang tăng trưởng tạo sụn của nhung hươu được thu nhận thành công bằng quy trình phân tách và thu nhận tế bào đơn của Allen và cộng sự [14]. Vì được thu nhận từ một khối mô đang tăng trường tạo sụn nên các tế bào này là một tập hợp của nhiều loại tế bào khác nhau: tế bào hồng cầu, tế bào sụn, nguyên bào sợi, tế bào tạo sụn, các loại tế bào của mô liên kết, tế bào đầu nguồn, tế bào gốc… Sau khi nuôi cấy sơ cấp, các tế bào có khả năng bám dính và phân chia sẽ được nhân sinh khối bằng cách cấy chuyền nhiều lần. Ngồi mục đích tăng sinh khối, việc cấy chuyền nhiều lần sẽ giúp loại bỏ dần các tế bào trưởng thành, chỉ giữ lại những tế bào có khả năng tăng sinh dài hạn và khả năng tự làm mới. Và theo khảo sát của đề tài, thời gian giữa hai lần phân bào của tế bào nhung hươu bước đầu được ghi nhận là khoảng 48 giờ. Kết quả này chưa được báo cáo nào công bố.
Thông thường, một tế bào sinh dưỡng trưởng thành sẽ phân chia khoảng 40 – 60 lần, sau đó chúng đi vào chu trình chết đã được định sẵn (apoptosis). Ở đây, trong khoảng thời gian 180 ngày duy trì ni cấy liên tục, với thời gian nhân đơi là 48 giờ như kết quả khảo sát thu được thì các tế bào nhung hươu đã phân chia được khoảng 90 lần và các tế bào này vẫn cịn có khả năng tăng sinh tiếp nếu tiếp tục ni cấy. Vậy, các tế bào nhung hươu có khả năng tăng sinh dài hạn, nghĩa là ngoài khả năng phân chia chúng cịn phải có khả năng tự làm mới – đây chính là một trong những đặc tính của tế bào gốc. Bên cạnh đó, các tế bào này cũng có kiểu hình tương tự như các tế bào nhung hươu có biểu hiện tính gốc được thu nhận bởi Berg và cộng sự hay bởi Rolf và cộng sự [17], [72].
Năm 2007, Debra K. Berg và cộng sự thu nhận một quần thể tế bào từ vùng màng xương của hươu đực – vùng sẽ khởi đầu tăng trưởng để tạo sừng và họ gọi đây là tế bào AP (viết tắt từ antlerogenic periosteum). Các tác giả này cho rằng tế bào AP là những tế bào có khả năng biệt hóa thành tế bào xương và tế bào mỡ, và đây là những tế bào chịu trách nhiệm trong sự tái sinh của sừng hươu, hay nói cách khác đây là những tế bào gốc [17].
Kết quả – Biện luận 58
A. Tế bào AP (X200) [17] B. Tế bào Stro-1+
(X40) [72]
Hình 3.26. Tế bào nhung hươu thu nhận bởi Berg và cs hay bởi Rolf và cs
Hình 3.27. Tế bào nhung hươu do đề tài thu nhận (X200 và X40)
Năm 2008, Hans J. Rolf và cộng sự cũng đã tiến hành thu nhận tế bào đơn từ nhung hươu. Các tác giả này sử dụng marker Stro – 1, CD271 và CD133 – các marker đặc trưng của tế bào gốc trung mô – để phân loại tế bào. Các tế bào nhung hươu có biểu hiện Stro – 1+
, CD271+ và CD133+ được thu nhận. Sau khi cảm ứng biệt hóa các tế bào này biến đổi thành tế bào tạo xương và tạo mỡ trong môi trường
Kết quả – Biện luận 59
tương ứng. Vậy nhung hươu có chứa các tế bào dương tính với các marker của tế bào gốc trung mô và các tế bào này lại có thể biệt hóa thành các loại tế bào trung mô trưởng thành hơn (tế bào tạo xương, tế bào tạo mỡ). Do đó, các tác giả này cho rằng, nhung hươu có chứa các tế bào tiền thân trung mô – là một dạng tế bào gốc [72].
Trong phạm vi của luận văn này, chúng tơi chưa có điều kiện để trang bị các marker và hóa chất biệt hóa như các tác giả trên. Nhưng dựa theo các tài liệu tham khảo được chúng tơi tự chuẩn bị các mơi trường biệt hóa với thành phần như đã nêu ở mục 2.3.
Đối với mơi trường biệt hóa xương, nếu là tế bào gốc trung mô, sau một thời gian dài tiếp xúc với các hóa chất dexamethasone, AsAP và beta – glycerol phosphate, các tế bào này sẽ tích tụ calcium trong tế bào chất, chất nền ngoại bào và sẽ biểu hiện các marker tạo xương như sialoprotein, osteocalcin và osteonectin. Dexamethasone là một glucocorticoid steroid có khả năng kích thích hoặc ức chế sự biệt hóa thành xương của tế bào gốc trung mô phụ thuộc vào nồng độ của nó (dexamethasone với nồng độ thấp sẽ kích thích biệt hóa thành xương, ngược lại nồng độ cao sẽ kích thích biệt hóa thành mỡ). AsAP sẽ làm q trình biệt hóa thành xương thuận lợi hơn thơng qua việc tổng hợp collagen và tác động kích thích lên sự tăng trưởng của tế bào. Trong khi đó, beta – glycerol phosphate kích thích hình thành chất nền được calci hóa do sự kết hợp với các tác động của dexamethasone và AsAP. Cuối cùng, EGF sẽ giúp cho tế bào tăng trưởng tốt hơn [10], [11], [12], [13], [19], [35], [36], [37], [43], [64].
Đối với môi trường biệt hóa mỡ, với việc bổ sung dexamethasone (0,5 µM),