- Rửa tiêu bản bằng nước và tấy bằng ethanol
- Nhuộm màu bổ sung bằng dung dịch Fuschin 0.1% hay safranin trong 1 – 2 phút. phút.
- Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô trong không khí, soi với vật kính dầu.
Trên tiêu bản nhuộm đúng, vi khuẩn G+ bắt màu tím, vi khuẩn G- bắt màu đỏ.
3.2.8. Xác định đường cong sinh trưởng của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis
Tiến hành nuôi mẫu giống vi khuẩn đã lựa chọn trong môi trường hoạt hoá, ở 480C, lắc 200 rpm. Cứ sau 2h lấy dịch nuôi cấy đem đo độ hấp thụ quang học
(Absorbance) ở bước sóng 620nm (A620).
3.2.9. Chọn lựa điều kiện nuôi cấy cho vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme chitosanase hoạt tính cao
Điều kiện nuôi cấy là một yếu tố vô cùng quan trọng giúp cho vi khuẩn sinh trưởng phát triển, cũng là yếu tố quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Điều kiện nuôi cấy là sự tổng hoà của các yếu tố như thành phần môi trường, pH môi trường, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy… Từng điều kiện nuôi cấy riêng rẽ đều có ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi khuẩn. Tìm được giá trị tối ưu của từng yếu tố riêng rẽ nhưng chưa chắc sự kết hợp của từng yếu tố riêng rẽ đó đã là tìm được điều kiện tốt nhất cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển, bởi lẽ giữa các yếu tố riêng rẽ đó lại có sự tác động tương tác lẫn nhau. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành chọn lựa điều kiện của tổng hợp các yếu tố nuôi cấy cho vi khuẩn. Trong điều kiện có hạn, và căn cứ vào các tài liệu đã công bố và một thí nghiệm khảo sát về khoảng nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất chitosan cho sự phát triển của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành tìm điều kiện nuôi cấy gồm ba yếu tố: nồng độ cơ chất chitosan trong khoảng [0.1%; 0.3%], pH môi trường trong khoảng [7; 9] và nhiệt độ [ 400C; 560C].
Từ phương trình hồi qui có dạng:
Y =b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b11X1X1 + b22X2X2 + b33X3X3 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3
Trong đó: X1 - biến số mã hoá của biến thực Z1-nhiệt độ nuôi cấy (T0C), khoảng khảo sát [40-560C], mức tâm: 480C, bước nhảy: 40C.
X2 - biến số mã hoá của biến thực Z2-pH môi trường nuôi cấy, khoảng khảo sát [7-9], mức tâm: 8, bước nhảy: 1.
X3 - biến số mã hoá của biến thực Z3-nồng độ cơ chất chitosan đưa vào môi trường nuôi cấy (%), khoảng khảo sát [0.1-0.3%], mức tâm: 0.2%, bước nhảy: 0.1%.
Y – hàm mục tiêu, là hoạt tính enzyme chitosanase (U/ml) b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23 - các hệ số của phương trình hồi quy
Chúng tôi xây dựng được ma trận qui hoạch thực nghiệm được thể hiện trong Bảng3.
Bảng 3.1. Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc 2, ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm)
Thí nghiệm số Z1 (Nhiệt độ,0C) Z2 (pH) Z3(Nồng độ cơ
chất, %) 1 56.0 8 0.2 2 40.0 8 0.2 3 52.0 9 0.2 4 44.0 7 0.2 5 52.0 7 0.2 6 44.0 9 0.2 7 52.0 8 0.3 8 44.0 8 0.1 9 52.0 8 0.1 10 48.0 9 0.1 11 44.0 8 0.3 12 48.0 7 0.3 13 48.0 8 0.2 Cách tiến hành:
- Hoạt hóa mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis vào môi trường đã chuẩn bị theo các công thức đã trình bày.
- Nuôi cấy trong 24h, tốc độ lắc 200rpm. - Mỗi công thức được lập lại 3 lần.
3.2.10. Phương pháp xác định hàm lượng protein
- Ly tâm dịch nuôi cấy 6000rpm, ở 40C, thu dịch enzyme thô. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch enzyme theo phương pháp Bradford (Nguyễn Văn Mùi, 2001).
Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G-
250 liên kết với protein trong dung dịch acid. Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein tương tác với nhóm kị nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hoá không xảy ra và có màu xanh xuất hiện.
Cách pha Coomassie Brilliant Blue G-250: Hoà tan 100mg Coomassie
Brilliant Blue G-250 trong 50ml cồn 95%. Bổ sung 100ml acid phosphoric 85% và 450ml
nước cất. Lọc dung dịch bằng giấy lọc, bổ sung 100ml glycerine. Đưa thể tích lên 1000ml. Sử dụng sau 24h.
Tiến hành:
+ Ống thí nghiệm: 0,1ml dung dịch protein cần xác định, thêm 5ml dung dịch thuốc nhuộm protein, trộn đều.
+ Ống đối chứng: 0,1ml dung dịch NaCl 0,15M, thêm 5ml dung dịch thuốc nhuộm protein, trộn đều.
+ Đem đo A ở bước sóng 595nm (A595) sau 2 phút đến 1h. Mỗi mẫu được làm lặp lại 2 lần.
+ Tính hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm theo đường chuẩn.
Dựng đường chuẩn protein:
Pha dãy protein từ 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6mg/ml. Tiến hành phản ứng với CBB G-250 theo thứ tự đã trình bày. Đo độ hấp phụ quang ở bước sóng 595nm (A595).
3.2.11. Thu nhận enzyme thô
3.2.11.1. Loại sinh khối của dịch nuôi cấy
Sau quá trình nuôi cấy vi khuẩn kết thúc, tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc
độ 6000 rpm ở 40C. Enzyme chitosanase là enzyme ngoại bào nên loại bỏ kết tủa và
thu lại phần dịch trong.
3.2.11.2. Cô đặc dung dịch enzyme thô
Dịch enzyme thô thu được sẽ được chia đều vào các bình thuỷ tinh rồi để đóng đá qua đêm. Sau đó tiến hành cô đặc dịch enzyme bằng phương pháp sấy đông khô. Phương pháp này không gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme do được thực hiện ở nhiệt độ rất thấp (-500C)
3.2.11.3. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn cồn
Tiến hành tủa phân đoạn bằng cồn ethylic lạnh. Cồn làm mất vỏ hydrat bao quanh các phân tử protein, làm cho các phân tử protein đông tụ lại với nhau dưới dạng tủa. Làm lạnh cồn tuyệt đối, làm lạnh dung dịch enzyme cần tủa. Lấy 200 ml dung dịch enzyme cô đặc đến 50 ml cho vào cốc thuỷ tinh, cho từ từ 30 ml cồn đã làm lạnh vào dung dịch enzyme này, khuấy đều, lại làm lạnh 15 - 30 phút. Sau đó, ly tâm lạnh ở tốc độ 6000v/ph trong 15phút, thu cặn tủa. Đánh dấu phân đoạn tủa 0 - 30%. Cặn thu
được hoà tan trong đệm phosphate pH 6,0 ta được dịch enzyme phân đoạn 0 - 30%. Còn dịch trong thu được tiếp tục cho thêm cồn đã làm lạnh để đạt 40% cồn. Tiến hành tương tự như trên cho đến phân đoạn 80 - 90%. Các tiểu phần thu được tiến hành xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein. Qua kết quả trên ta sẽ xác định được hoạt tính enzyme cao nhất ở phân đoạn nào.
3.2.11.4. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn amoni sulphat
Canh trường vi sinh vật sau khi nuôi cấy đem li tâm để thu lấy dịch trong. Lấy 200ml đem cô đặc sau đấy đem cô đặc còn 50ml cho vào cốc thuỷ tinh, sau đó bổ sung muối amoni sunphat ở các nồng độ khác nhau.
Khối lượng amoni sunphat được tính theo công thức:
M = a.V/1000
Trong đó: V là thể tích enzyme đem kết tủa
a là giá trị tra bảng khối lượng được trình bày ở phần phụ lục
Thời gian kết tủa 30 phút, trên máy khuấy từ ở 00C. Trong quá trình cho muối vào phải cho từ từ để tránh hiện tượng biến tính protein cục bộ, sau đó cho enzyme vào tủ lạnh để qua đêm, sau đó đem li tâm thu tủa ở 40C, vận tốc 9000 vòng/phút trong 30 phút. Tủa thu được đem hoà tan trong đệm axetat 0,2M pH = 5. Xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein ở các phân đoạn.
3.2. 12. Phương pháp thống kê và xử lí kết quả
Các kết quả thu được sẽ được xử lí bằng phần mềm Excel, SAS, NEMRODW.
Phần IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của mẫu giống vi khuẩn
Bacillus licheniformis
Chúng tôi tiến hành cấy chấm điểm trên môi trường thử hoạt tính để thử hoạt tính sơ bộ. Sau thời gian nuôi cấy 1 ngày, xác định các mẫu có hoạt tính bằng cách đổ một lớp mỏng dung dịch Lugol lên bề mặt đĩa thạch. Vì chitosanase là enzyme đặc hiệu đối với cơ chất chitosan nên những vi sinh vật có khả năng sinh chitosanase ngoại bào sẽ tiết enzyme ra ngoài môi trường để phân giải cơ chất chitosan tạo nên vòng phân giải trên môi trường. Enzyme có hoạt tính càng cao thì vòng phân giải càng to, rộng và sáng.
Qua quá trình xác định hoạt tính của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis
trên môi trường thử hoạt tính, chúng tôi thấy vòng phân giải cơ chất rộng và sáng chứng tỏ mẫu giống vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase cao. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành xác định hoạt tính của mẫu giống vi khuẩn này và so sánh với các chủng giống vi khuẩn khác bằng cách sử dụng phương pháp đục lỗ thạch để thử hoạt tính enzyme chitosanase.
Hình 4.1: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis
Sau khi tiến hành hoạt hoá, nuôi cấy mẫu vi khuẩn trên, chúng tôi ly tâm dịch nuôi
cấy để loại bỏ kết tủa, thu dịch nuôi cấy có chứa enzyme thô của từng mẫu. Các mẫu enzyme thô này được thử hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ thạch được tiến hành như sau: đổ môi trường agar – chitosan ra các đĩa petri, để nguội. Dùng dụng cụ đục lỗ môi trường có đường kính 1cm, đục các lỗ trên đĩa thạch (3 lỗ/đĩa). Hút 50µl dịch nổi enzyme cho vào mỗi lỗ thạch, để 2h trong tủ lạnh, sau đó đem ủ ở 48oC, 24h.
Kết quả được trình bày ở Bảng 4.1 và Hình 4.2.
Bảng 4.1: Hiệu số đường kính vòng phân giải của enzyme chitosanase từ mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis và các giống vi khuẩn khác
Mẫu DC1 4DC HC5 Bacillus
licheniformis
Hiệu số đường kính vòng
Phân giải của Chitosanase (cm) 3.0 2.6 2.8 3.5
Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy hoạt tính của enzyme chitosanase của mẫu giống vi khuẩn Baccilus licheniformis là cao so với các mẫu giống vi khuẩn khác đã từng được nghiên cứu. Những mẫu giống vi khuẩn như DC1, 4DC, HC5 thì hiệu số đường kính vòng phân giải của chitosanase chỉ vào khoảng 2,5-3cm, còn giống vi khuẩn Bacillus licheniformis hiệu số đường kính vòng phân giải đạt 3.5cm.
Hình 4.2: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống
Bacillus licheniformis
Để khẳng định chắc chắn mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh ra enzyme chitosanase có hoạt tính cao, chúng tôi tiếp tục xác định hoạt tính enzyme chitosanase bằng phương pháp acid dinitrosalicylic của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis,
đồng thời so sánh hoạt tính enzyme chitosanase với 3 mẫu giống DC1, 4DC, HC5 ( là những mẫu giống đã được nghiên cứu để thu nhận enzyme chitosanase ).
Enzyme thô của các mẫu giống vi khuẩn này được chuẩn bị và tiến hành xác định hoạt tính như đã mô tả trong phần phương pháp. Kết quả được trình bày trong Bảng 4.2 và Đồ thị 4.1
Bảng 4.2: Hoạt tính chitosanase của các mẫu được nghiên cứu
Mẫu Hoạt tính (U/ml)
Bacillus licheniformis 1.23 DC1 1.10 4DC 1.05 HC5 0.89
Đồ thị 4.1: Hoạt tính chitosanase của 4 mẫu được nghiên cứu
Qua Bảng 4.2 và Đồ thị 4.1 cho thấy mẫu giống vi khuẩn có hoạt tính enzyme chitosanase cao nhất là mẫu Bacillus licheniformis (1.23 U/ml), tiếp theo là mẫu DC1 (1.10), mẫu 4DC (1.05 U/ml) và mẫu HC5 (0.89 U/ml). Qua tham khảo nghiên cứu của một số nhà khoa học trên thế giới thì với hoạt tính enzyme chitosanase thô của dịch nuôi cấy lớn hơn 1U/ml là rất khả quan, ví dụ như hoạt tính của enzyme chitosanase sinh ra bởi vi khuẩn Bacillus cereus là 1.34 U/ml (Piza và cộng sự, 1999) … Trên cơ sở kết quả thu được trên, chúng tôi thấy rằng mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh ra enzyme chitosanase có hoạt tính cao, nên chúng tôi quyết định chọn mẫu giống vi khuẩn này để tiếp tục nghiên cứu.
4.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis licheniformis
4.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Sau khi cấy trang mẫu giống Bacillus licheniformis và nuôi ở nhiệt độ 480C trong 24h, hình thái khuẩn lạc quan sát được như Hình 4.3, Hình 4.4
Hình 4.3, 4.4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn
Bacillus licheniformis
Khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis đầu tiên có màu trắng sau thấy có váng tím trên bề mặt, khuẩn lạc tròn, nhăn, thường mọc thành cụm
Bacillus licheniformis
4.2.2. Đặc điểm hình thái tế bào
Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram, quan sát trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100 lần, hình thái tế bào quan sát được như Hình 4.5.
Hình 4.5: Đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis
Qua tiêu bản nhuộm Gram, ta thấy tế bào có hình que, bắt màu thuốc nhuộm safranin (màu tím). Như vậy giống vi khuẩn Bacillus licheniformis là trực khuẩn Gram (+). Và là loại vi khuẩn có khả năng di động.
4.3. Chọn lựa thời gian tiếp giống và điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi khuẩn Bacillus licheniformis hợp enzyme chitosanase của vi khuẩn Bacillus licheniformis
4.3.1. Thời gian tiếp giống
Việc xác đinh cong sinh trưởng của vi khuẩn sẽ cho ta biết sự biến đổi của số lượng tế bào vi sinh vật theo thời gian trong môi trường nuôi cấy tĩnh (tính theo hàm log) được thể hiện qua các pha, từ đó giúp chúng ta lựa chọn được đâu là thời điểm tiếp giống thích hợp nhất.
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy mẫu giống vi khuẩn đã lựa chọn trong môi trường hoạt hoá, ở 480C, tốc độ lắc 200 rpm, cứ 2h lại lấy dịch nuôi cấy đem đo độ hấp thụ quang học (A620) trong 36h. Kết quả được trình bày trong Bảng 4.3 và Đồ thị 4.2
Bảng 4.3: Sự phát triển của vi khuẩn Bacillus licheniformis theo thời gian Thời gian (h) A620 0 0.042 2 0.065 4 0.104 6 0.135 8 0.189 10 0.358 12 0.582 14 0.653 16 0.866 18 0.967 20 1.032 22 1.105 24 1.118 26 1.104 28 1.1 30 1.091 32 1.052 34 1.042 36 1.036 32
Đồ thị 4.2: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis
theo thời gian
Qua Bảng 4.4 và Đồ thị 4.2 ta thấy trong khoảng thời gian từ 0-8h, chỉ số A620
tăng rất chậm do đây là pha mở đầu trong chu kì sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, giai đoạn này chúng bắt đầu làm quen với môi trường dinh dưỡng. Ở pha mở đầu, vi sinh vật đạt tốc độ sinh trưởng cực đại nhưng tế bào chưa phân chia nên số lượng tế bào chưa tăng hoặc tăng không đáng kể. Từ 8-24h, chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh trưởng và phát triển theo luỹ thừa và đạt cực đại ở 24h (A620 = 1.118), tế bào ở trạng thái động học và được coi là những tế bào tiêu chuẩn. Khoảng thời gian này chính là pha log của vi sinh vật. Ở pha này, vi sinh vật sinh trưởng phát triển nhanh nhất, hình thái và đăc điểm sinh lý của vi sinh vật thể hiện điển hình nhất. Quá trình trao đổi chất mạnh nên sinh khối vi sinh vật và các sản phẩm trao đổi chất đạt cao nhất ở pha này. Vì vậy trong sản xuất chúng ta nên chú ý đến pha này, tạo điều kiện thuận lợi nhằm thu được lượng sản phẩm nhiều nhất. Từ 24-30h tốc độ phát triển bắt đầu chậm lại và số lượng tế bào tương đối ổn định, đây được coi là pha ổn định của vi sinh vật, vì ở pha này, quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Nguyên nhân của pha ổn định là sự tích luỹ các sản phẩm trao đổi chất có hại cho vi sinh vật và việc cạn kiệt chất dinh dưỡng. Từ 30h trở đi, số lượng tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis giảm. Đây là pha tử vong của vi sinh vật. Nguyên nhân của pha này chưa thật rõ ràng nhưng có liên quan đến điều kiện bất lợi của môi trường cũng như sự cạn kiệt về nguồn dinh dưỡng.
Như vậy, chất lượng giống tốt nhất và thích hợp nhất cho việc tiếp giống vào