- Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô trong không khí, soi với vật kính dầu
4.4. Thu nhận enzyme chitosanase
4.4.1. Nuôi cấy và thu nhận enzyme
Thực hiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis ở điều kiện nuôi cấy tối ưu đã chọn lựa được ở trên ( tại 480C, pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan = 0.2), dịch nuôi cấy được ly tâm loại bỏ cặn và thu lại phần dịch trong chính là enzyme thô. Hoạt tính chitosanase thu được trong lần nuôi cấy này là 1.780 U/ml.
4.4.2 Cô đặc dịch enzyme thô
Dịch enzyme thô thu được sau quá trình nuôi cấy có nồng độ protein thấp, do vậy khi thực hiện các bước tinh sạch tiếp theo như tủa phân đoạn bằng cồn hay muối sẽ khó khăn do phải sử dụng lượng hoá chất lớn và dụng cụ với thể tích lớn…Do vậy việc cô đặc dịch enzyme thô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho bước tủa phân đoạn sau đó. Phương pháp được sử dụng là sấy đông khô, phương pháp này khá hiệu quả do quá trình thực hiện ở nhiệt độ thấp (-500C) nên giảm thiểu bất hoạt enzyme.
Thể tích dịch thô ban đầu là 200ml sẽ được cô đặc còn 50ml (cô đặc 4 lần). Hoạt tính của enzyme và nồng độ protein được xác định lại. Tuy nhiên, do bị cô đặc nên nồng độ các chất sẽ tăng lên rất nhiều và kết quả tính được sẽ không phù hợp với các đường chuẩn glucosamine và đường chuẩn protein đã có, do vậy để đảm bảo độ chính xác của các giá trị đo chúng tôi quyết định pha loãng dịch cô đặc 4 lần, sau đó tiến hành theo các phương pháp đã định. Kết quả cô đặc được thể hiện trong Bảng 4.6
Bảng 4.6 Hoạt tính của enzyme chitosanase trước và sau khi cô đặc Dịch enzyme Hoạt tính(U/ml) Nồng độ protein(mg/ml) Hoạt tính riêng(U/mg) Trước cô đặc 1.780 0.09 19.10
Sau khi cô đặc 6.83 0.34 20.04
Qua Bảng 4.5 ta thấy hoạt tính của enzyme sau khi cô đặc (6.83 U/ml) đã tăng 3.8 lần so với trước khi cô đặc (1.78U/ml) và nồng độ protein sau khi cô đặc (0.34mg/ml) tăng 3.6 lần so với trước khi cô đặc (0.09mg/ml). Vì hoạt tính riêng trước cô đặc là 19.10U/mg, sau cô đặc là 20.04U/mg nên cô đặc bằng phương pháp sấy đông khô không làm thay đổi hoạt tính enzyme chitosanase. Kết quả này cho ta thấy cô đặc bằng phương pháp sấy đông khô là một phương pháp rất hiệu quả.
4.4.3. Tinh sạch sơ bộ enzyme chitosanase
Sau khi cô đặc, chúng tôi tiến hành tinh sạch sơ bộ enzyme của mẫu giống vi khuẩn này. Việc xác định hoạt tính enzyme chitosanase và hàm lượng protein ở từng phân đoạn nhằm tìm ra phân đoạn cho hoạt tính enzyme cao nhất. Đây là việc rất quan trọng vì nó quyết định đến hiệu suất thu hồi và chất lượng enzyme. Do vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện tủa phân đoạn bằng hai phương pháp là tủa cồn và tủa bằng muối amoni sunphate. Phương pháp thực hiện như đã trình bày trong phần phương pháp nghiên cứu, lấy 50ml dịch enzyme đã cô đặc để tủa phân đoạn, kết tủa thu được đem hoà tan trong 5ml đệm phosphate pH = 6 (với tủa phân đoạn bằng cồn) và hoà tan trong 5ml đệm acetate pH =5.5(với tủa phân đoạn băng muối amoni sunphate).
Khảo sát hai phương pháp tủa phân đoạn bằng cồn và muối amoni sunphate, thấy rằng cả hai phương pháp đều có khả năng phân tách protein thành các phân đoạn thể hiện hoạt tính của chitosanase khác nhau.