3.2.1. Bảo quản và giữ giống
- Sau khi tiếp nhận, các mẫu giống vi khuẩn được cấy truyền vào môi trường
thạch nghiêng và nuôi cấy ở tủ ấm 48oC để giữ giống. Sau khi các giống đã mọc tốt,
bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3 – 4oC, sau 2 - 3 tuần phải cấy
truyền lại một lần. Bảo quản giống là khâu hết sức quan trọng.
3.2.2. Thử khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi khuẩn
Bacillus licheniformis
Sử dụng môi trường thử hoạt tính. Cấy chấm điểm trên môi trường thử hoạt tính để thử hoạt tính sơ bộ. Sau thời gian nuôi cấy 1 ngày, xác định các mẫu có hoạt tính bằng cách đổ một lớp mỏng dung dịch Lugol lên bề mặt đĩa thạch. Vì chitosanase là enzyme đặc hiệu đối với cơ chất chitosan nên những vi sinh vật có khả năng sinh chitosanase ngoại bào sẽ tiết enzyme ra ngoài môi trường để phân giải cơ chất chitosan tạo nên vòng phân giải trên môi trường. Enzyme có hoạt tính càng cao thì vòng phân giải càng to, rộng và sáng. Những mẫu giống có hoạt tính chitosanase cao sẽ được nghiên cứu tiếp ở điều kiện nuôi cấy thích hợp.
3.2.3. Nuôi cấy mẫu giống có hoạt tính
Môi trường nuôi cấy được phân chia vào các bình tam giác vô trùng có thể tích 250 ml. Cấy mẫu giống đã hoạt hoá (hoạt hóa 1 vòng que cấy trong ống nghiệm với thể tích môi trường hoạt hoá 5ml) vào môi trường nuôi cấy ở chế độ vô trùng. Quá trình nuôi cấy được tiến hành trên máy lắc ở chế độ 200 rpm, 48oC trong thời gian 1 ngày
3.2.4. Xác định đường kính vòng phân giải của enzyme thô (phương pháp đục lỗ thạch)
Sau khi dừng nuôi cấy, tiến hành ly tâm để loại bỏ kết tủa, thu dịch nuôi cấy. Dịch enzyme thu được sẽ được đem đi phân tích hoạt tính enzyme để tiếp tục tuyển chọn ra mẫu giống có khả năng sinh tổng hợp chitosanase hoạt tính cao.
Đổ môi trường agar – chitosan ra các đĩa petri, để nguội. Dùng dụng cụ đục lỗ môi trường có đường kính 1cm, đục các lỗ trên đĩa thạch (3 lỗ/đĩa). Hút 50µl dịch nổi enzyme cho vào mỗi lỗ thạch, để 2h trong tủ lạnh, sau đó đem ủ ở 48oC, 22h sau đó quan sát, đo đường kính vòng phân giải của các mẫu, chọn lọc các mẫu có hoạt tính tốt để nghiên cứu tiếp.
3.2.5. Chuẩn bị cơ chất chitosan
Cân 2,35g chitosan (>85%) dạng vảy ngâm trong 500ml dung dịch acid acetic 1% trong 48h. Sau đó ly tâm loại bỏ cặn không tan, rồi lên thể tích 1000ml bằng nước cất. Dùng NaOH 0,1N và HCl 0,1N chỉnh pH của dung dịch chitosan về pH 8, ta được dung dịch chitosan 0,2%, pH = 8 để sử dụng.
3.2.6. Xác định hoạt tính enzyme chitosanase bằng phương pháp acid dinitrosalicylic
Nguyên tắc: Khi enzyme chitosanase thuỷ phân chitosan sẽ tạo các
Oligosaccharide có đầu chứa đường khử D-glucosamine. Phương pháp acid dinitrosalicylic xác định sự có mặt của nhóm (C = O) trong đường khử, oxy hoá nhóm aldehyt trong đường, đồng thời 3,5-dinitrosalicylic acid bị khử tạo thành 3-amino,5- nitrosalicylic acid trong môi trường kiềm.
CHO- oxh nhóm COO-
3,5 – dinitrosalicylic acid 3-amino,5-nitrosalicylic acid
Sulfite được bổ sung vào phản ứng để hấp thụ oxi hoà tan trong môi trường vì oxi hoà tan không cần cho phản ứng màu.Theo trình tự phản ứng, một phân tử đường sẽ phản ứng với 1 phân tử DNS (Wang, 2007).
Xác định hoạt độ enzyme chitosanase bằng phương pháp acid dinitrosalicylic (DNS) (Nguyễn Văn Mùi, 2001).
Nguyên liệu: • Tác nhân phản ứng DNS gồm: o Dinitrosalicylic acid: 10 g o Phenol: 2 g o Sodium sulfite: 0.5 g o Sodium hydroxide: 10 g o Thêm nước cất đến : 1lít
• Potassium sodium tartrate solution, 40% • Tiến hành:
- Cho 3ml DNS + 3ml glucose vào ống nghiệm (đậy kín)
Khử
- Đun ở 90oC trong 5 - 10phút → dung dịch có màu nâu đỏ
- Thêm 1ml potassium sodium tartrate (Kali natri tartrat) 40% vào phản ứng để ổn định màu
- Làm lạnh đến nhiệt độ phòng
- Đo độ hấp thụ quang học (Absorbance) ở bước sóng 575nm (A575).
Dựng đường chuẩn Glucosamine: Pha dãy glucosamine chuẩn từ 0; 0,5;
1,0; 1,5; …9,0; 9,5; 10mg trong 1ml. Cho 3ml dung dịch glucosamine chuẩn vào một
ống nghiệm, thêm 3ml thuốc thử DNS. Đun sôi 90oC trong 5phút. Thêm 1ml dung
dịch potassium sodium tartrate 40%. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ
quang học ở bước sóng 575nm (A575). Vẽ đường chuẩn glucosamine với trục tung là
độ hấp thụ quang học A575, trục hoành là nồng độ glucosamine.
Chuẩn bị mẫu và đo độ hấp thụ quang học của các mẫu enzyme:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm, một ống thí nghiệm, một ống đối chứng. Lấy 2ml dịch enzyme cho vào mỗi ống, ở ống đối chứng cho thêm 100μl dung dịch NaOH 10N để bất hoạt enzyme. Sau đó, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch chitosan 0,2%. Đặt 2 ống nghiệm trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 50oC trong 30phút. Sau đó, nhỏ 100 μl NaOH 10N vào ống thí nghiệm để dừng phản ứng. Từ mỗi ống này lấy ra 3ml rồi thêm vào 3ml DNS, đặt 2 ống nghiệm trong bể ổn nhiệt 90oC trong 5 - 10phút. Sau đó, nhỏ vào mỗi ống 1ml dung dịch Kali natri tartrate 40%. Rồi để nguội đến nhiệt độ phòng và đo A575.
- Mỗi mẫu được làm lặp lại 3 lần.
- Kết quả hoạt tính enzyme được tính theo phương trình đường chuẩn.
Định nghĩa đơn vị hoạt tính enzyme chitosanase: Một đơn vị hoạt tính enzyme chitosanase là lượng enzyme cần thiết xúc tác phản ứng thuỷ phân chitosan để giải phóng ra 1μmol đường khử trong thời gian 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn của phương pháp phân tích.
Từ định nghĩa ta có công thức tính hoạt tính enzyme chitosanase là:
Hoạt tính = X*4*1000/30*180*2
Trong đó : X là nồng độ glucosamine tính theo đường chuẩn (mg/ml)
4 là tổng thể tích dịch sau phản ứng (2ml dịch enzyme và 2ml dung dịch chitosan)
30 là thời gian phản ứng
180 là khối lượng phân tử glucosamine 2 là thể tích enzyme trong phản ứng.
3.2.7. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của mẫu giống vi khuẩn được tuyển chọn