- Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô trong không khí, soi với vật kính dầu
4.3.1. Thời gian tiếp giống
Việc xác đinh cong sinh trưởng của vi khuẩn sẽ cho ta biết sự biến đổi của số lượng tế bào vi sinh vật theo thời gian trong môi trường nuôi cấy tĩnh (tính theo hàm log) được thể hiện qua các pha, từ đó giúp chúng ta lựa chọn được đâu là thời điểm tiếp giống thích hợp nhất.
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy mẫu giống vi khuẩn đã lựa chọn trong môi trường hoạt hoá, ở 480C, tốc độ lắc 200 rpm, cứ 2h lại lấy dịch nuôi cấy đem đo độ hấp thụ quang học (A620) trong 36h. Kết quả được trình bày trong Bảng 4.3 và Đồ thị 4.2
Bảng 4.3: Sự phát triển của vi khuẩn Bacillus licheniformis theo thời gian Thời gian (h) A620 0 0.042 2 0.065 4 0.104 6 0.135 8 0.189 10 0.358 12 0.582 14 0.653 16 0.866 18 0.967 20 1.032 22 1.105 24 1.118 26 1.104 28 1.1 30 1.091 32 1.052 34 1.042 36 1.036 32
Đồ thị 4.2: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis
theo thời gian
Qua Bảng 4.4 và Đồ thị 4.2 ta thấy trong khoảng thời gian từ 0-8h, chỉ số A620
tăng rất chậm do đây là pha mở đầu trong chu kì sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, giai đoạn này chúng bắt đầu làm quen với môi trường dinh dưỡng. Ở pha mở đầu, vi sinh vật đạt tốc độ sinh trưởng cực đại nhưng tế bào chưa phân chia nên số lượng tế bào chưa tăng hoặc tăng không đáng kể. Từ 8-24h, chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh trưởng và phát triển theo luỹ thừa và đạt cực đại ở 24h (A620 = 1.118), tế bào ở trạng thái động học và được coi là những tế bào tiêu chuẩn. Khoảng thời gian này chính là pha log của vi sinh vật. Ở pha này, vi sinh vật sinh trưởng phát triển nhanh nhất, hình thái và đăc điểm sinh lý của vi sinh vật thể hiện điển hình nhất. Quá trình trao đổi chất mạnh nên sinh khối vi sinh vật và các sản phẩm trao đổi chất đạt cao nhất ở pha này. Vì vậy trong sản xuất chúng ta nên chú ý đến pha này, tạo điều kiện thuận lợi nhằm thu được lượng sản phẩm nhiều nhất. Từ 24-30h tốc độ phát triển bắt đầu chậm lại và số lượng tế bào tương đối ổn định, đây được coi là pha ổn định của vi sinh vật, vì ở pha này, quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Nguyên nhân của pha ổn định là sự tích luỹ các sản phẩm trao đổi chất có hại cho vi sinh vật và việc cạn kiệt chất dinh dưỡng. Từ 30h trở đi, số lượng tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis giảm. Đây là pha tử vong của vi sinh vật. Nguyên nhân của pha này chưa thật rõ ràng nhưng có liên quan đến điều kiện bất lợi của môi trường cũng như sự cạn kiệt về nguồn dinh dưỡng.
Như vậy, chất lượng giống tốt nhất và thích hợp nhất cho việc tiếp giống vào môi trường lên men là ở giai đoạn 8-24h (pha log) trên môi trường hoạt hoá hoặc nhân giống.
4.3.2. Điều kiện nuôi cấy tối ưu
Điều kiện nuôi cấy là yếu tố vô cùng quan trọng giúp cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển, cũng là yếu tố quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Điều kiện nuôi cấy là sự tổng hoà của các yếu tố như thành phần môi trường, pH môi trường, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy…. Các yếu tố này có tác động khác nhau đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme chitosanase. Qua tham khảo một số tài liệu và các thí nghiệm khảo sát được, chúng tôi nhận thấy yếu tố nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất chitosan là những yếu tố có ảnh hưởng mạnh hơn cả đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase. Trong thực tế, hoạt tính của enzyme chitosanase thu được không chỉ bị ảnh hưởng bởi từng yếu tố riêng lẻ mà còn bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa các yếu tố với nhau. Vì thế nếu chỉ dựa trên các nghiên cứu rời rạc để đưa ra điều kiện nuôi cấy tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi khuẩn thì kết quả sẽ không đạt độ chính xác cao. Do vậy chúng tôi tiến hành qui hoạch thực nghiêm nhằm lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitosan từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis. Chọn ba yếu tố có ảnh hưởng nhiều nhất đến khả năng sinh hoạt tính chitosanase của vi khuẩn là nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất chitosan đưa vào môi trường. Chúng tôi sử dụng phương pháp qui hoạch trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm để đưa ra phương trình hồi qui biểu diễn mối quan hệ định lượng giữa hoạt tính enzyme chitosanase và ba yếu tố khảo sát.
Các thí nghiệm được tiến hành và kết quả được thể hiện như trong Bảng 4.4
Bảng 4.4. Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc 2, ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm)
Thí
nghiệm số Z1 (Nhiệt độ,0C) Z2 (pH) Z3(Nồng độ cơ chất, %)
Y (Hoạt tính Chitosanase ,U/ml) 1 56.0 8 0.2 0.619 2 40.0 8 0.2 0.950 3 52.0 9 0.2 0.581 4 44.0 7 0.2 0.695 5 52.0 7 0.2 0.807 6 44.0 9 0.2 0.570 7 52.0 8 0.3 0.688 8 44.0 8 0.1 0.731 9 52.0 8 0.1 0.910 34
10 48.0 9 0.1 1.267
11 44.0 8 0.3 0.681
12 48.0 7 0.3 1.412
13 48.0 8 0.2 1.697
Bảng 4.5: Hệ số của phương trình hồi quy
Nom Coefficient Signif. %
b0 1.6940 < 0.01 *** b1 0.0845 < 0.01 *** b2 0.1767 < 0.01 *** b3 -0.0253 < 0.01 *** b11 0.2080 < 0.01 *** b22 -0.1737 < 0.01 *** b33 -0.4232 < 0.01 *** b12 -0.0602 < 0.01 *** b13 -0.0948 < 0.01 *** b23 -0.1575 < 0.01 *** *** mức ý nghĩa 0.001
Từ Bảng 4.5, chúng tôi thấy b2 = 0.1767 đạt giá trị lớn nhất nên pH (biến số X2) là yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến khả năng sinh enzyme chitosanase của vi khuẩn
Bacillus licheniformis. Tuy nhiên, nhiệt độ (biến số X2) cũng là yếu tố ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng sinh chitosanase (vì giá trị b1 = 0.0845 ). Nhưng khi xét đồng thời cả hai yếu tố thì pH và nồng độ cơ chất chitosan (b23 = -0.1575) lại gây tác động mạnh không kém yếu tố pH, nhiệt độ khi xét riêng rẽ. Trong Bảng 4.5 giá trị b3, b22, b33, b12, b13, b23 mang dấu âm (-) có nghĩa là các yếu tố này thể hiện nghịch biến với giá trị của Y ( hoạt tính của enzyme chitosanase). Tức là nếu giá trị các biến X3, X22, X33, X12, X13, X23 tăng thì hoạt tính của enzyme chitosanase giảm và ngược lại. Giá trị b1, b2, b11 mang dấu dương (+) có nghĩa là nếu giá trị các biến X1, X2, X11 tăng thì hoạt tính của enzyme chitosanase cũng tăng.
Sau khi tính toán kiểm tra các hệ số của phương trình hồi qui và kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi qui với thực nghiệm, chúng tôi thu được phương trình sau:
Y = 1.6940 + 0.0845X1 + 0.1767X2 – 0.0253X3 + 0.0280X1X1 - 0.1737X2X2 – 0.4232X3X3 – 0.0602X1X2 – 0.0948X1X3 - 0.1575X2X3
Từ kết quả thu được trên ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc 2, ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm). chúng tôi vẽ được ba đồ thị sau:
Đồ Thị 4.3. Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ,0C), X2 (pH) và Y (hoạt tính enzyme, U/ml).
Trên Đồ thị 4.3, khi cố định yếu tố X3 = 0.2% (nồng độ cơ chất chitosan) và biến đổi hai yếu tố X1 trong khoảng ( 40 – 560C), X2 trong khoảng (7 – 9) thì hoạt tính enzyme chitosanase đạt cao nhất là 1.697U/ml tại nhiệt độ 480C, pH = 8.
Đồ thị 4.4. Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ, 0C), X3 (nồng độ cơ chất chitosan, %) và Y (hoạt tính enzyme, U/ml).
Trên Đồ thị 4.4, khi cố định yếu tố X2 = 8 (pH) biến đổi hai yếu tố X1 trong khoảng ( 40 – 560C), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme chitosanase đạt cao nhất là 1.697U/ml tại 48 0C và nồng độ cơ chất chitosan là 0.2%.
Đồ thị 4.5. Mối quan hệ của X2 (pH), X3 (nồng độ cơ chất chitosan,%) và Y (hoạt tính enzyme, U/ml).
Trên Đồ thị 4.5 khi cố định yếu tố X1 = 48 (nhiệt độ) biến đổi hai yếu tố X2 trong khoảng ( 7 – 9), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme chitosanase đạt cao nhất là 1.697U/ml tại pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan là 0.2%.
Từ mặt phẳng trong Đồ thị 4.3, Đồ thị 4.4 và Đồ thị 4.5 và Bảng 4.4, chúng tôi kết luận rằng khi xét đồng thời cả ba yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất chitosan thì giá trị Y sẽ đạt cực đại khi X1 = 48, X2 = 8 và X3 = 0.2. Vậy điều kiện nuôi cấy tối ưu để vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh tổng hợp được enzyme chitosanase có hoạt tính cao tại 480C, pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan đưa vào môi trường nuôi cấy là 0.2%.