Theo Fukamizo và Brezinski (1997) đã xác định được các sản phẩm dị vòng thu được từ quá trình thuỷ phân chitosan đều là dạng α, điều đó cho thấy rằng chitosanase là một enzyme chuyển hoá.
Chitosanase có khả năng nhận dạng liên kết đặc trưng trong chuỗi chitosan để phân cắt. Vị trí phân cắt đó là liên kết β-(1-4)-glycoside giữa các phân tử D-Glucosamine hoặc giữa D-Glucosamine và N-Acetyl-D-Glucosamine.
Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào vị trí β-(1- 4)-glycoside giữa hai D-Glucosamine, còn một số chitosanase lại có khả năng tấn công vào liên kết này giữa hai phân tử D-Glucosamine và giữa D-Glucosamine với phần N-Acetyl- D-Glucosamine còn lại. Bảng 2.2thể hiện vị trí liên kết bị tấn công bởi một số chitosanase
Bảng 2.2: Kiểu phân cắt của các loại chitosanase
Chitosanase
Kiểu phân cắt
Loại I
-Bacillus pumilus BN-262
-Penicillium islandicumStreptomyces sp. N174 Loại II
-Bacillus sp. No 7-M
Loại III
-Streptomyces griseus HUT 6037 -Bacillus circulans MH-K1 -Nocardia orientalis
-Bacillus circulans WL-12
: GlcNAc : GlcN
Cùng với những kết quả thu được khi quan sát dạng tinh thể học và các vùng biến đổi cho phép chúng ta kết luận rằng đầu Glu22 hoạt động như là nơi cho proton, trong khi đầu Asp4 hoạt hoá 1 phân tử nước sau đó tấn công vào vị trí C-1 của phân tử đường khử tại vị trí xúc tác.
Cơ chế chuyển hoá này được duy trì liên tục trên thực tế là nhờ 2 đầu xúc tác có khoảng cách 13,8Å, cao hơn những enzyme chuyển hoá khác gần 10Å.
Cơ chế xúc tác của chitosanase được thể hiện trong Hình 2.5
Hình 2.5: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase
Sản phẩm phản ứng của enzyme chitosanase được nghiên cứu bằng cách sử dụng dung dịch chitosan và một vài COS làm cơ chất. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) (thin-layer chromatography) cho thấy rằng enzyme chitosanase đã giải phóng ra
COS từ chitosan, phần lớn là các COS dài hơn (GlcN)2 bằng cách phân cắt nội phân
tử. Enzyme này không thể thuỷ phân được (GlcN)2 hoặc (GlcN)3. Còn (GlcN)4 và (GlcN)5 thì bền với hoạt tính xúc tác của enzyme này. Tuy nhiên, chitosan oligosaccharide (GlcN)6 và (GlcN)7 được thuỷ phân hoàn toàn sau 15h ủ. (GlcN)6 chủ yếu được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)3 và (GlcN)2 + (GlcN)4 nhưng (GlcN)2 + (GlcN)4 thì ít hơn nhiều, [Rồi sau đó, (GlcN)4 → (GlcN)2 + (GlcN)2]. Nó cũng cho thấy rằng (GlcN)7 được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)4. Kết quả này chỉ ra rằng để phản ứng xảy ra nhanh, cơ chất chitosan nên có chiều dài chuỗi phân tử bằng hoặc dài hơn (GlcN)6, sự phân cắt liên kết glycoside xảy ra tốt nhất tại trung tâm của mối liên kết hexameric và sinh ra (GlcN)3 là sản phẩm chủ yếu. Thực tế, enzyme chitosanase thể hiện hoạt tính đối với chitosan cao hơn so với các oligosaccharide mạch ngắn hơn (Choi và cộng sự, 2003).