Phổ hấp thụ hồng ngoại của L - tyrosin và các phức chất được ghi trên máy quang phổ hồng ngoại Mangna IR 760 Spectrometer ESP Nicinet của Mỹ (Viện hoá học - Viện khoa học công nghệ Việt Nam), trong vùng tần số từ 400 ÷ 4000 cm-1, các mẫu được trộn đều, nghiền nhỏ và ép viên với KBr. Sự gán ghép các dải hấp thụ trong các phổ dựa theo tài liệu [17]. Kết quả phổ hấp thụ hồng ngoại của L - tyrosin và các phức chất được trình bày trên hình 2.4, 2.5, 2.6, 2.7 và bảng 2.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.4. Phổ hấp thụ hồng ngoại của L - tyrosin
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.6. Phổ hấp thụ hồng ngoại của phức chất Tb(Tyr)3.3H2O
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.3. Các tần số hấp thụ đặc trưng (cm-1) của L - tyrosin và các phức chất
Hợp chất OH NH3 COO as OO C s ∆ OO as C s L - tyrosin - 3136,34 1596,35 1450,40 145,95 Gd(Tyr)3.3H2O 3480,24 3223,91 1586,71 1414,61 172,10 Tb(Tyr)3.3H2O 3480,24 3216,79 1581,34 1413,04 168,30 Dy (Tyr)3.3H2O 3440,30 3218,50 1579,00 1412,11 166,89 (-) Không xác định
Trong phổ hồng ngoại của L - tyrosin dải hấp thụ ở tần số 3136,34 cm-1
quy cho dao động hóa trị của nhóm NH3+. Dải hấp thụ ở 1596,35 cm-1
và 1450,40 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị bất đối xứng và dao động hóa trị
đối xứng của nhóm COO-
.
Chúng tôi nhận thấy phổ hấp thụ hồng ngoại của các phức chất đều khác với phổ của phối tử tự do về hình dạng cũng như vị trí của các dải hấp thụ. Điều này cho biết sự tạo phức đã xảy ra giữa các ion Gd3+
, Tb3+, Dy3+ với L - tyrosin.
So sánh phổ hồng ngoại của phức chất và phổ hồng ngoại của L - tyrosin ở trạng thái tự do (hình 2.3) thấy dải hấp thụ ở 1596 cm-1
đặc trưng cho dao động hóa trị bất đối xứng ( COO
as
)của nhóm COO-
trên phổ của L - tyrosin tự do dịch chuyển về vùng tần số thấp hơn (1586,71 cm-1
÷ 1579,00 cm-1), dải hấp thụ ở 1450,40 cm-1
đặc trưng cho dao động hóa trị đối xứng ( COO
s
) của nhóm COO- lại dịch chuyển về vùng tần số thấp hơn (1414,61cm-1 ÷ 1412,11 cm-1) trên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
phổ của các phức chất. Điều này chứng tỏ nhóm cacboxyl của L - tyrosin đã phối trí với ion Ln3+. Sự chênh lệch tần số dao động hóa trị bất đối xứng và
đối xứng của nhóm COO- (∆ OO
as
C s (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
) của phức chất so với L - tyrosin tự do
chứng tỏ L - tyrosin đã liên kết với Ln3+
qua nguyên tử oxi của nhóm cacboxyl. Dải dao động hóa trị (NH3) của nhóm +
NH3 trên phổ của L - tyrosin (3136,34 cm-1) dịch chuyển lên vùng tần số cao hơn ( 3216,79 cm-1
÷ 3223,91 cm-1) trên phổ của phức chất, chứng tỏ L - tyrosin cũng đã liên với
Ln3+ qua nguyên tử nitơ của nhóm amin. Ngoài ra trên phổ của các phức chất
còn xuất hiện dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm OH-
của
nước (3440,30 cm-1
÷ 3480,24 cm-1). Điều này chứng tỏ trong thành phần của phức (Ln3+
: Gd3+, Tb3+, Dy3+) có chứa nước và hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích nhiệt ở trên .
2.5. Nghiên cứu các phức chất bằng phƣơng pháp đo độ dẫn điện
Độ dẫn điện của dung dịch L - tyrosin, các dung dịch phức chất
Ln(Tyr)3.nH2O được đo trên máy FIGURE7 của Mỹ (khoa Hoá học- Trường
đại học sư phạm Thái Nguyên). Chỉnh máy bằng dung dịch chuẩn NaCl nồng độ 692 ppm và 7230 ppm (các dung dịch chuẩn có kèm theo máy).
Chuẩn bị dung dịch L - tyrosin, các dung dịch phức chất đều có nồng
độ 10-3M trong dung môi hữu cơ đimetyl sunphoxit (DMSO).
Kết quả được chỉ ra ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Độ dẫn điện mol phân tử (μ) của L - Tyrosin và các phức chất trong DMSO ở 25 ± 0,50C Dung dịch ( 10-3 M ) μ ( Ω-1 .cm2.mol-1) L - tyrosin 11,6 Gd(Tyr)3.3H2O 20,20 Tb(Tyr)3.3H2O 18,27 Dy(Tyr)3.3H2O 19,83
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả bảng 2.4 cho thấy, độ dẫn điện mol phân tử của L - Tyrosin và các phức chất quá nhỏ, coi như không điện ly vì L- Tyrosin là phối tử trung hòa và các phức chất là những chất không điện li.
2.6. Bƣớc đầu thăm dò hoạt tính sinh học của một số phức chất của NTĐH với L - tyrosin
2.6.1. Hoạt tính kháng khuẩn của phức Tb(Tyr)3.3H2O
2.6.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của phức chất Tb(Tyr)3.3H2O đến vi khuẩn Salmonella và E.coli
Mẫu nghiên cứu được tiến hành ở phòng vi sinh, trường Đại học Y - Dược, Đại học Thái Nguyên.
Kết quả được chỉ ra ở hình 2.8, 2.9, 2.10, 2.11và bảng 2.5, 2.6.
Hình 2.8. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn Salmonella của
phức Tb(Tyr)3.3H2O
Hình 2.9. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn E.coli của phức (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tb(Tyr)3.3H2O
Trong đó: 1- Nồng độ phức : 2 500 μ g/ml 2- Nồng độ phức : 5 000 μ g/ml
3- Nồng độ phức : 10 000 μ g/ml 4- Nồng độ phức : 20 000 μ g/ml
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của phức chất Tb(Tyr)3.3H2O STT Nồng độ phức chất (μ g/ml) Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Salmonella E.coli 1 2 500 15 12 2 5 000 18 16 3 10 000 21 20 4 20 000 24 23
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 2500 ÷ 20 000 μ g/ml,
phức chất Tb(Tyr)3.3H2O có tác dụng ức chế các vi khuẩn kiểm định,
sự ức chế tăng dần theo nồng độ.
2.6.1.2. So sánh ảnh hưởng của Tb(Tyr)3.3H2O, TbCl3, L - tyrosin đến vi khuẩn Salmonella và E.coli
Sau khi khảo sát, phức chất Tb(Tyr)3.3H2O có tác dụng ức chế đến các vi khuẩn Salmonella và E.coli ở khoảng nồng độ nhất định. Để so sánh ảnh hưởng của Tb(Tyr)3.3H2O, TbCl3, L - tyrosin đến 2 loại vi khuẩn trên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các mẫu:
1- Phức Tb(Tyr)3.3H2O nồng độ 10. 000 μ g/ml 2- Muối TbCl3 nồng độ 10.000 μ g/ml 3- Phối tử L - tyrosin nồng độ 30. 000 μ g/ml
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.10. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn Salmonella
giữa Tb(Tyr)3.3H2O, TbCl3, L - tyrosin
Hình 2.11. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn E.coli giữa
Tb(Tyr)3.3H2O, TbCl3, L - tyrosin
Bảng 2.6. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của Tb(Tyr)3.3H2O, TbCl3, L - tyrosin STT Nồng độ Tb(Tyr)3.3H2O, TbCl3, L - tyrosin (μ g/ml) Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Salmonell a E.coli 1 Tb(Tyr)3.3H2O 10 000 21 20 2 TbCl3 10 000 26 24 3 L - tyrosin 30 000 0 0
Nhận xét: Phức chất Tb(Tyr)3.3H2O và muối TbCl3 đều có hoạt tính kháng khuẩn với cả hai loại vi khuẩn Salmonella và E.coli, phức chất Tb(Tyr)3.3H2O có hoạt tính kháng khuẩn kém hơn so với muối TbCl3, phối tử L - tyrosin không có hoạt tính kháng khuẩn.
2.6.2. Ảnh hưởng của hàm lượng phức Tb(Tyr)3.3H2O đến sự nảy mầm và
phát triển mầm của hạt lạc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chọn 6 mẫu hạt lạc, mỗi mẫu 50 hạt kích thước tương đối đồng đều (khối lượng 30,15±0,01 g ). Ngâm hạt trong các dung dịch phức chất có nồng độ 30, 60, 120, 180, 240 ppm (mẫu so sánh ngâm trong nước cất). Thể tích các dung dịch phức chất và nước cất đem ngâm là 100 ml, sau thời gian 24 giờ vớt ra và ủ hạt trong cốc cỡ 500 ml, được lót dưới và đậy trên bằng giấy lọc, để trong tủ ấm ở 300
C. Các dung dịch ngâm được thu hồi để tưới lại lần sau. Hàng ngày tưới hạt bằng các dung dịch phức và nước cất theo thứ tự các mẫu, ngày tưới 3 lần, mỗi lần 30 phút.
Sau khi mầm hạt phát triển được số ngày tuổi nhất định, chúng tôi tiến hành xác định tỷ lệ nảy mầm của hạt, đo độ dài thân và rễ của từng cây trong các mẫu thí nghiệm. Các thí nghiệm được lặp lại 7 lần.
2.6.2.2. Ảnh hưởng của phức chất đến sự nảy mầm của hạt lạc
Sau khi ủ hạt được một ngày, đếm số hạt nảy mầm từ đó tính tỷ lệ nảy mầm của hạt. Kết quả được trình bày ở bảng 2.7.
Bảng 2.7. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng phức Tb(Tyr)3.3H2O đến sự nảy mầm của hạt lạc Mẫu 1 2 3 4 5 6 Nồng độ phức chất (ppm) 0(H2O) 30 60 120 180 240 Tỷ lệ nảy mầm (%) 88,00 83,67 80,00 74,03 68,02 62,13 n 7 Nhận xét: Phức chất có tác dụng ức chế sự nảy mầm của hạt lạc. Sự ức chế làm giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt lạc. Sự ức chế rõ rệt ở nồng độ 120 ppm và sự ức chế tăng theo nồng độ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Khi mầm hạt phát triển được 4 ngày tuổi, chúng tôi tiến hành đo chiều cao của mầm và độ dài của rễ.
Kết quả được trình bày ở bảng 2.8, hình 2.12. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.8. Ảnh hƣởng của nồng độ phức chất Tb(Tyr)3.3H2O đến sự phát triển mầm của hạt lạc
n : độ lặp lại
d T: là độ dài trung bình của thân mầm lạc
d R : là độ dài trung bình của rễ mầm lạc
AT là % độ dài thân so với đối chứng AR là % độ dài rễ so với đối chứng
AT, AR= SS X d d .100 (%)
d SS: Độ dài trung bình thân, rễ của mầm lạc ở mẫu so sánh (đối chứng).
d X: Độ dài trung bình thân, rễ của mẫu xử lý.
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Nồng độ phức chất (ppm)
0(H2O) 30 60 120 180 240
Thời gian (ngày) 4
d T (cm) 3,65 3,34 3,10 2,87 2,52 2,02
d R (cm) 3,45 3,23 2,77 2,50 2,21 1,74
AT (%) 100 91,50 84,93 78,63 69,04 55,34
AR (%) 100 93,62 80,29 72,40 64,06 50,43
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 2.12. Ảnh hƣởng của nồng độ phức chất Tb(Tyr)3.3H2O đến sự phát triển mầm hạt lạc Trong đó: Mẫu 1 2 3 4 5 6 Nồng độ phức chất (ppm) 0(H2O) 30 60 120 180 240
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 2.8, hình 2.12 cho thấy phức chất có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt lạc. Sự ức chế làm giảm chiều cao của mầm và độ dài của rễ, mầm phát triển mập hơn, ra nhiều rễ phụ hơn. Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 30 ÷ 240 ppm, phức chất có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt lạc . Sự ức chế rõ rệt ở nồng độ 120 ppm và tăng theo nồng độ.
2.6.2.4. So sánh ảnh hưởng của phức chất, ion kim loại và phối tử đến sự nảy mầm của hạt lạc
Để so sánh ảnh hưởng của phức Tb(Tyr)3.3H2O, ion kim loại và phối tử đến sự nảy mầm của hạt lạc, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các mẫu :
Mẫu 1: H2O
Mẫu 2: Dung dịch phức Tb(Tyr)3.3H2Onồng độ 120 ppm.
Mẫu 3: Dung dịch muối Tb3+
nồng độ 120 ppm. Mẫu 4: Dung dịch tyrosin nồng độ 360 ppm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.9. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng phức Tb(Tyr)3.3H2O, Tb3+, và Tyr đến sự nảy mầm của hạt lạc
STT 1 2 3 4
Mẫu H2O Tb(Tyr)3.3H2O Tb3+ Tyr
Nồng độ (ppm) 0 120 120 360
Tỷ lệ nảy mầm(%) 88,00 74,03 81,25 69,92 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
n 7
Nhận xét: Cũng như phức chất, phối tử và ion trung tâm có tác dụng ức chế sự nảy mầm của hạt lạc. Phức chất có tác dụng ức chế kém hơn phối tử và tốt hơn ion trung tâm.
2.6.2.5. So sánh ảnh hưởng của phức chất, ion kim loại và phối tử đến sự phát triển mầm của hạt lạc
Khi mầm hạt phát triển được 4 ngày tuổi (ở thí nghiệm 3.3.1.4), chúng tôi tiến hành đo chiều cao của mầm và độ dài của rễ.
Kết quả được trình bày ở bảng 2.10, hình 2.13
Bảng 2.10. Kết quả so sánh ảnh hƣởng của phức Tb(Tyr)3.3H2O, Tb3+, và Tyr đến sự phát triển mầm của hạt lạc
Mẫu 1 2 3 4
Dung dịch H2O Tb(Tyr)3.3H2O Tb3+ Tyr
Nồng độ (ppm) 0 120 120 360 Thờigian (ngày) 4 d T (cm) 3,65 2,94 3,17 2,25 d R (cm) 3,45 2,66 2,93 1,78 AT (%) 100 80,55 86,84 61,64 AR (%) 100 77,10 84,93 51,59 n 7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.13. Ảnh hƣởng của phức Tb(Tyr)3.3H2O, Tb3+, và Tyr đến sự phát
triển mầm của hạt lạc.
Trong đó:
Mẫu 1 2 3 4
Dung dịch H2O Tb(Tyr)3.3H2O Tb3+ Tyr
Nồng độ (ppm) 0 120 120 360
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 2.10, hình 2.13 cho thấy cũng như phức chất, phối tử và ion kim loại có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt lạc. Phức chất có tác dụng ức chế kém hơn phối tử và tốt hơn ion kim loại.
2.6.3. Ảnh hưởng của phức chất đến một số chỉ tiêu sinh hóa có trong mầm hạt lạc hạt lạc
- Phương pháp thí nghiệm: Cân mỗi mẫu 3 gam cây giá lạc nghiền bằng cối chày sứ, thêm vào 50 ml dung dịch đệm photphat có pH = 10. Trộn đều, sau đó để trong tủ lạnh trong 10 giờ ở 4oC lọc và li tâm, lấy phần dịch trong. Dịch này đem xác định hàm lượng protein, làm tương tự như trên
thay dung dịch đệm photphat có pH = 6,5 để xác định hàm lượng proteaza
và dung dịch đệm photphat có pH = 6 đểxác định hàm lượng α- amilaza có
trong mầm lạc.
- Để xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry, hoạt độ proteaza theo phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xây dựng các đường chuẩn:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Xây dựng đường chuẩn xác định protein: Dùng ống hút lấy 0,1 ÷ 0,5 ml dung dịch protein huyết thanh bò (0,5 mg/ml) cho vào 5 ống nghiệm đánh số
từ 1 đến 5. Cho vào mỗi ống 5 ml dung dịch D (gồm 48 ml dung dịch Na2CO3
2% trong NaOH 0,1N, 1 ml dung dịch CuSO4 0,5% và 1ml dung dịch NaKC4H4O6 1%), thêm nước cất đến cùng thể tích là 9 ml. Lắc đều, để yên 15 phút, bổ sung vào mỗi ống 1 ml dung dịch E (thuốc thử Folin-Ciocalto pha loãng với nước cất tỉ lệ 1:1), lại lắc đều và để yên 30 phút.
Mẫu so sánh không có protein: 5 ml dung dịch D, 4 ml nước và 1 ml dung dịch E. Đo độ hấp thụ quang A của các dung dịch ở bước sóng 750 nm [3]. Kết quả được trình bày ở bảng 2.11, hình 2.14.
Bảng 2.11. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào khối lƣợng protein
Mẫu 1 2 3 4 5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khối lượng protein
(huyết thanh bò) (mg) 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 A750 0,0601 0,0986 0,1331 0,1821 0,2153 y = 0.7878x + 0.0197 R2 = 0.9968 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 mg protein M ật độ qu ang Hình 2.14. Đƣờng chuẩn xác định protein
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt độ proteaza: Dùng ống hút lấy những thể tích xác định dung dịch chuẩn tyrosin 1μmol/ml cho vào các bình định mức cỡ 25 ml. Dùng dung dịch HCl 0,2N pha loãng đến vạch để được các dung dịch tyrosin có nồng độ 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 μmol/ml. Lấy 1 ml ở mỗi ống nghiệm trên cho vào 5 ống nghiệm có đánh số thứ tự,
thêm vào mỗi ống 4 ml dung dịch Na2CO3 6%. Lắc đều, thêm vào 1ml thuốc
thử Folin-Ciocalteu đã pha loãng 5 lần, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng.