Đây cũng là phương pháp thuận tiện, được áp dụng rộng rãi để nghiên cứu phức chất. Nguyên tắc của phương pháp là: xác lập một số trị số trung bình mà độ dẫn điện mol(μ) hoặc độ dẫn điện đương lượng (λ) của dung dịch phức chất dao động xung quanh chúng. Các giá trị này sẽ đặc trưng cho tính chất điện li của các phân tử phức chất trong dung dịch.
Khi nghiên cứu phức chất bằng phương pháp này, trước tiên ta xác định độ dẫn điện riêng χ của dung dịch cần nghiên cứu ở một nhiệt độ nhất định, từ đó ta tính được độ dẫn điện mol phân tử μ hoặc độ dẫn điện đương lượng λ.
Đo độ dẫn điện mol là độ dẫn điện của dung dịch chứa một mol hợp
chất phức chất, đặt giữa hai điện cực song song cách nhau 1 cm. Còn gọi là độ dẫn điện mol phân tử và được tính theo công thức:
= .1000
M
C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Độ dẫn điện đương lượng λ (Ω-1
.cm2. đlg-1) tính theo công thức: λ = .1000 N C (Ω-1.cm2. đlg-1 ) Trong đó:
: độ dẫn điện riêng của dung dịch (Ω-1.cm-1) CM : nồng độ mol/l của dung dịch (M)
CN: nồng độ đương lượng của dung dịch (N)
Nhờ phép đo độ dẫn điện dung dịch có thể tìm được số lượng ion mà phức chất phân li ra, từ đó giới hạn số lượng công thức giả định khi nghiên cứu cấu trúc của một phức chất mới.
Khi áp dụng các định luật đặc trưng của chất điện li mạnh thông thường cho phức chất có sự tương ứng gần đúng là cùng nồng độ dung dịch 10-3mol/l ở 250C những phức chất phân li thành hai ion trong dung dịch sẽ có độ dẫn điện mol gần 100 (Ω-1
.cm2.mol-1), những phức chất phân li thành 3, 4 và 5 ion sẽ có độ dẫn điện mol khoảng 250, 400 và 500 ( Ω-1
.cm2.mol-1). Đối với phức chất có bản chất trung hoà điện thì độ dẫn điện rất bé [9].
Độ dẫn điện của dung dịch phức chất phụ thuộc vào các yếu tố sau:
Bản chất của ion trung tâm
Bản chất của phối tử
Cấu tạo của ion phức
Dung lượng phối trí của các phối tử
Các phức chất mà phân tử của chúng có các vòng 5 hoặc 6 cạnh đều rất bền. Vì vậy độ dẫn điện của dung dịch của chúng thực tế không thay đổi theo thời gian và nhỏ hơn độ dẫn điện của dung dịch phức chất không vòng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Dựa theo kết quả đo độ dẫn điện ở một chừng mực nào đấy có thể suy đoán về độ bền tương đối của các phức chất có cùng kiểu cấu tạo với nhau. Đối với các phức chất có cùng kiểu cấu tạo thì dung dịch của phức chất nào có độ dẫn điện lớn hơn sẽ kém bền hơn [9].
1.6. Đối tƣợng thăm dò hoạt tính sinh học của phức chất
1.6.1 Giới thiệu về vi khuẩn Salmonella và E.coli
Vi khuẩn (bacterium, bacteria) đôi khi còn được gọi là vi trùng, nó thuộc loại ký sinh trùng. Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước nhỏ và thường có cấu trúc tế bào đơn giản không có nhân, bộ khung tế bào và các bào quan như ty thể và lục lạp.
* Salmonella là loại trực khuẩn gram âm, có lông, có sức đề kháng tốt ở ngoại cảnh. Trong đất sống được vài tháng, trong nước sống được vài tuần, trong thực phẩm đông lạnh được 2 - 3 tháng và sống cả ở những thực phẩm có nồng độ muối cao, ở 1000oC phải hơn 5 phút mới diệt được.
*Vi khuẩn E.coli thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc. Chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng.
- E.coli là loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế
bào, kích thước trung bình 2- 3µm x 0,5 µm; trong những điều kiện không thích hợp vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E. coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông . E. coli Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường ở nhiệt độ từ 5- 40oC, pH 7,4.Trong những điều kiện thích hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình1.1. Hình thái vi khuẩn Salmonella Hình 1.2. Hình thái vi khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn có thể có ích hoặc có hại cho môi trường, động vật, cả con người. Vai trò của vi khuẩn trong gây bệnh và truyền bệnh rất quan trọng. Một số là tác nhân gây bệnh (pathogen) và gây ra bệnh uốn ván (tetanus), sốt thương hàn (typhoid fever), giang mai (syphilis), tả (cholera), bệnh lây qua thực phẩm (foodborne illness) và lao (tuberculosis). Ở thực vật, vi khuẩn gây mụn lá, và héo cây. Các hình thức lây nhiễm gồm qua tiếp xúc,
không khí, thực phẩm, nước và côn trùng [11].
E. coli cũng là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E. coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương.
Vi khuẩn E.coli nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật. Chúng trở nên gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chúng.
Salmonella thường vào cơ thể qua đường ăn uống, salmonella truyền sang người do ăn phải đồ ăn nhiễm vi khuẩn salmonella. Vi khuẩn salmonella có thể nhiễm gẩn như bất cứ loại thức ăn nào, như trứng tươi, sản phẩm trứng, rau tươi, ngũ cốc và nước .. khuẩn Salmonella có thể gây tiêu chảy, viêm đường ruột, hoặc nặng hơn nữa là bệnh thương hàn. nhiễm khuẩn máu, viêm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ruột. Bệnh thương hàn có triệu chứng ban đầu là sốt kèm theo lạnh run, sốt tăng dần kéo dài trong 2 tuần, gây ra suy nhược, biếng ăn, mệt mỏi, gan lách to, xuất huyết ngoài da, lượng bạch cầu giảm. Có thể nói đây là một trong các bệnh có nhiều biến chứng nguy hiểm nhất trong số các bệnh lây truyền qua đường tiêu hóa.
Trong đề tài này, chúng tôi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của phức chất tổng hợp được đối với hai loại vi khuẩn là Salmonella và E.coli.
1.6.2 Giới thiệu về cây lạc, protein, proteaza và α-amilaza
1.6.2.1 Vài nét về cây lạc
Lạc (danh pháp khoa học: Arachis hypogaea ) hay còn gọi là đậu phộng
hay đậu phụng, là một loài cây thực phẩm thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Trung và Nam Mỹ. Trong số các loại cây có dầu ngắn ngày, cây lạc đứng thứ hai sau đậu tương về diện tích cũng như sản lượng. Ở Việt Nam, hiện nay lạc là một trong các mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng, đem lại thu nhập nhanh cho nông dân và là nguồn thu ngoại tệ cho đất nước. Toàn bộ diện tích trồng lạc trong năm 2011 ước tính đến 50.000 ha [11].
Một số đặc điểm về cây lạc: - Rễ: rễ chùm.
- Thân: thân thảo, cao từ 3-50 cm.
- Lá: Lá mọc đối, kép hình lông chim với bốn lá chét, kích thước lá chét dài 1-7 cm và rộng 1-3 cm.
- Hoa: Hoa dạng hoa đậu điển hình màu vàng có điểm gân đỏ, cuống
hoa dài 2-4 cm.
- Quả: Sau khi thụ phấn, quả phát triển thành một dạng quả đậu dài 3-7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Lạc là cây thực phẩm rất giàu năng lượng vì hạt lạc chứa 32-55% lipit,16-34% protein, 13,3% gluxit, các axit amin, canxi, phốt pho, sắt,... Theo nghiên cứu, các chất trong hạt lạc có tác dụng phòng ngừa lão hoá phòng ngừa bệnh xơ cứng động mạch và bệnh ở mạch vành tim, thúc đẩy tế bào não phát triển, giúp phát triển trí tuệ của trẻ em, làm giảm cholesterol trong máu, Màng bọc ngoài (vỏ lụa) của nhân lạc có tác dụng cầm máu tốt. Trong vỏ cứng của củ lạc có chất luteolin có tác dụng hạ huyết áp, hạ mỡ máu, ngăn chặn sỏi mật, tăng cường trí nhớ và sức khỏe não, Chất teta-sitoserol (Sit) có trong dầu lạc có tác dụng chống lại bệnh ung thư bằng cách ngăn chặn sự phát triển của các tế bào.
Cây lạc được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới: Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ…Châu Á đứng đầu thế giới cả về diện tích và sản lượng (chiếm 60% diện tích trồng và 70% sản lượng của thế giới)
1.6.2.2. Giới thiệu về protein, proteaza và α-amilaza
* Protein: là các polime có khối lượng phân tử lớn, chủ yếu bao gồm các L-amino axit kết hợp với nhau qua liên kết peptit. Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sinh vật nhưng lại có tính đặc thù cao cho loài, từng cá thể của cùng một loài, từng cơ quan, mô của cùng một cá thể. Protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng, là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sống. Có thể kể đến một số chức năng quan trọng của protein như: xúc tác, vận tải chuyển động, bảo vệ, truyền xung thần kinh, điều hòa, kiến tạo chống đỡ cơ học, dự trữ năng lượng…
Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, H, O, N, một số còn có một lượng nhỏ S. Ngoài các nguyên tố trên, protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca, … . [4].
*Proteaza: (peptit – hidrolaza 3.4) xúc tác quá trình thủy phân liên kết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
là các axit amin. Ngoài ra, nhiều proteaza cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin.
Proteaza cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virut) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê…). Trong cơ thể, các proteaza đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptit có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng…Ngoài ra, các proteaza có thể hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường đó là tăng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN…[2]
* α-amilaza: Được tìm thấy trong hạt cây một và hai lá mầm, được chia thành 2 loại: α- amilaza và β-amilaza. Cơ chất của chúng là tinh bột và oligosacharide.
α -amilaza thuộc nhóm hiđrolase có trong cơ thể động vật (nước bọt, tụy tạng), thực vật (hạt hoà thảo nảy mầm), nấm mốc, vi khuẩn. α- amilaza phân giải các liên kết 1,4- glicozit ở giữa chuỗi mạch polisaccazit tạo thành các đextrin phân tử thấp. Do đó dưới tác dụng của enzim này làm dung dịch tinh bột nhanh chóng bắt màu với dung dịch iốt và bị giảm độ nhớt mạnh, ion canxi có tác dụng làm bền cấu trúc không gian của phân tử enzim. α - amilaza tương đối bền với nhiệt hơn so với các amilaza khác và kém bền với các axit .
Trong đề tài này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của phức chất tổng hợp được đến hàm lượng protein, proteaza và α - amilaza
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
2.1.1.1. Dung dịch đệm pH = 4,2 (CH3COONH4, CH3COOH)
Lấy 3,99ml CH3COOH 60,05%, d=1,05 g/ml hòa tan vào 150ml nước
cất hai lần trong bình định mức 250ml. Lấy 0,5ml NH3 25%, d=0,88 g/ml hòa tan trong 40ml nước cất hai lần rồi cho vào bình định mức trên, thêm nước cất hai lần đến vạch định mức ta được dung dịch đệm có pH = 4,2 (kiểm tra lại bằng máy đo pH).
2.1.1.2. Dung dịch asenazo (III) 0,1%
Cân một lượng chính xác asenazo (III) trên cân điện tử 4 số. Dùng nước cất hai lần hòa tan sơ bộ, nhỏ từng giọt Na2CO3 0,1% cho đến khi
dung dịch có màu xanh tím. Đun nóng hỗn hợp ở 60oC, tiếp theo nhỏ từng
giọt axit HCl loãng cho đến khi dung dịch có màu tím đỏ và định mức đến thể tích cần thiết [6].
2.1.1.3. Dung dịch DTPA 10-3M ( đietylen triamin pentaaxetic)
Cân lượng chính xác DTPA (M=393,35 g.mol-1) trên cân điện tử 4 số,
hòa tan bằng nước cất hai lần, định mức đến thể tích cần thiết.
2.1.1.4. Dung dịch LnCl3 10-2M (Ln: Gd, Tb, Dy)
Các dung dịch này được điều chế từ các oxit tương ứng như sau: cân chính xác một lượng oxit Gd2O3, Tb2O3, Dy2O3, theo tính toán trên cân điện tử 4 số, hòa tan bằng dung dịch axit HCl 1N (được pha từ ống chuẩn). Cô cạn trên bếp cách thủy ở 80oC, sau đó hòa tan bằng nước cất hai lần và định mức đến thể tích xác định. Dùng phương pháp chuẩn độ complexon với chất chuẩn
là DTPA 10-3M, thuốc thử asenazo (III) 0,1%, đệm pH = 4,2 để xác định lại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.1.1.5. Dung dịch L - tyrosin 10-3
M
Cân chính xác lượng L - tyrosin trên cân điện tử 4 số, sau đó hòa tan và định mức bằng nước cất hai lần đến thể tích cần thiết.
2.1.1.6 . Dung dịch LiOH 0,1M
Cân chính xác lượng LiOH trên cân điện tử 4 số, hòa tan và định mức bằng nước cất hai lần đến thể tích cần thiết.
2.1.1.7. Dung dịch DMSO (đimetyl sunphoxit) 10-3
M
Lấy một thể tích xác định dung dich DMSO 98%, hòa tan và định mức bằng nước cất hai lần đến thể tích cần thiết.
2.1.1.8.Thuốc thử Folin-Xiocanto
Chuẩn bị bình cầu đáy tròn 1 lít có lắp ống sinh hàn ngược: 700ml nước cất, 100 g Na2W2O4.2H2O (natrivonframat) và 25 g Na2Mo2O4.2H2O
(natrimolipdat), 50ml dung dịch axit H3PO4 85%, 100ml dung dịch HCl đặc.
Lắp ống sinh hàn ngược vào bình đun sôi trong 10 giờ, sau đó thêm 150g Li2SO4.2H2O, 50ml nước cất và 5 giọt Br2, lắc đều tiếp tục đun 15phút không có ống sinh hàn để loại Br2 thừa. Làm lạnh và thêm nước cất đến 1 lít thu được dung dịch Folin – Xiocanto có màu vàng, bảo quản dung dịch trong lọ màu có nút nhám [3 ].
2.1.1.9 Một số hóa chất khác
Dung dịch tyrosin 1μmol/ml. Dung dịch NaCl 0,1%.
Dung dịch axit tricloaxetic 5%. Dung dịch tinh bột 1%.
Dung dịch axit sunfosalisilic 20%. Dung dịch Na2CO3 6%.
Dung dịch CuSO4 0,5%. Dung dịch iôt 0,3%.
Dung dịch NaKC4H4O6 0,1%. Dung dịch HCl 0,2N.
Dung dịch Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.1.2. Thiết bị
Máy quang phổ hồng ngoại Mangna IR 760 Spectrometer ESP Nicinet (Mỹ). Máy phân tích nhiệt DTG – 60H Shimazu (Nhật).
Máy đo độ dẫn điện FIGURE 7 (Mỹ).
Máy phân tích nguyên tố Analytik Jena AG, Customer Service, Konrad – zuse – str.1, 07745 Jena (Đức).
Kính hiển vi kỹ thuật số Pro way optics electronics (Trung Quốc). Ngoài ra còn sử dụng các thiết bị và dụng cụ khác:
Cân điện tử 4 số PRECISA XT 120A. Máy pH Presica 900 (Thụy Sĩ).
Máy khuấy từ IKA Labortechnik (Đức). Tủ sấy (Ba Lan).
Lò nung (Trung Quốc).
Bếp cách thủy có rơle tự ngắt, Bình hút ẩm. Bình định mức, pipet, buret,…
2.2. Tổng hợp các phức chất rắn và xác định thành phần của chúng
2.2.1. Tổng hợp các phức chất rắn
Phức chất của đất hiếm với L - tyrosin được tổng hợp theo tài liệu [15]. Hòa tan L - tyrosin (0,543g, 3mmol) và LiOH.H2O (0,126g, 3mmol) trong nước và dung dịch này được đun nóng trên bếp cách thủy ở 70o
C trong khoảng thời gian 20 phút. Thêm dung dịch muối LnCl3 (1mmol) vào dung
dịch Tyr-LiOH.H2O. Phản ứng xảy ra ngay tức thời, nhưng vẫn tiếp tục khuấy
hỗn hợp trên bếp khuấy từ ở nhiệt độ 50oC trong khoảng thời gian 15 phút.
Phức chất rắn được lọc rửa bằng nước cất nóng và làm khô trong bình hút ẩm.