Hoạt tính sinh học của các phức chất nói chung được phát hiện từ đầu thế kỷ XIX. Phức chất của các aminoaxit được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp và y học. Trong nông nghiệp, phân bón có thành phần phức vòng của các kim loại chuyển tiếp, NTĐH cho hiệu quả cao hơn nhiều so với các loại phân vô cơ, hữu cơ truyền thống, vì chúng có những đặc tính: dễ hấp thụ, bền trong khoảng pH rộng, không bị các vi khuẩn phá hủy trong thời gian dài, có thể loại được các tác nhân gây độc hại cho người, gia súc và môi trường như các kim loại nặng, ion NO3-. Mặt khác, chúng bổ sung các nguyên tố cần thiết cho cây, mà các nguyên tố này trong đất càng nghèo đi do quá trình photphat hóa, sunfat hóa, trôi rữa,...
Trên thế giới, ở nhiều nước như Anh, Mỹ, Liên Xô cũ đã sử dụng phức chất dạng vòng càng của các kim loại sinh học vào ngành trồng trọt, nhằm làm tăng năng suất của mùa màng, chống bệnh vàng lá, rụng quả xanh,...
Phức hỗn hợp của nhiều amino axit với nhiều NTĐH bón cho cây trồng đã làm tăng độ màu mỡ của đất, tăng sản lượng của cây trồng ( lúa mì tăng 11,7%, chè tăng 21,53%) [20].
Trong y học, các viên thuốc chứa lượng rất nhỏ các NTĐH đã được phát hiện và thử nghiệm trên thực tế lâm sàng. Phức của axit aspactic với các NTĐH hóa trị III và kẽm có tính chất làm giảm hàm lượng đường trong máu và nước tiểu. Sự hấp thụ và trao đổi chất của một vài α - aminoaxit có liên quan đến tế bào ung thư của cơ thể [9].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ngày nay vấn đề nghiên cứu tìm kiếm và tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học ít độc, có tác dụng chọn lọc cao đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Tuy nhiên số công trình nghiên cứu về vấn đề này đã công bố còn ít. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thăm dò hoạt tính sinh học của phức đất hiếm với L - tyrosin đã tổng hợp đối với sự nảy mầm, phát triển mầm của hạt lạc , ảnh hưởng của phức chất đến một số chỉ tiêu sinh hóa có trong mầm hạt lạc và trên vi sinh vật kiểm định.
1.5. Một số phƣơng pháp nghiên cứu phức chất
1.5.1. Phương pháp phân tích nhiệt
Đây là phương pháp hóa lý hiện đại để nghiên cứu phức rắn, áp dụng phương pháp này cho ta nhiều thông tin về phức chất.
Cơ sở của phương pháp phân tích nhiệt là: dựa vào các hiệu ứng nhiệt để nghiên cứu những quá trình phát sinh ra khi đun nóng hoặc làm nguội chất. Xây dựng giản đồ biểu thị sự biến đổi tính chất theo thời gian, dựa vào các giản đồ này có thể suy luận được thành phần và nhiều dữ kiện khác của các chất khi xảy ra các hiệu ứng nhiệt. Đồ thị biểu diễn sự biến đổi tính chất của một chất trong hệ tọa độ: nhiệt độ - thời gian gọi là giản đồ nhiệt. Thông thường giản đồ nhiệt có ba đường:
Đường T chỉ sự biến đổi đơn thuần của mẫu nghiên cứu theo thời gian. Đường này cho biết nhiệt độ xảy ra sự biến hóa.
Đường DTA cũng chỉ ra sự biến đổi của nhiệt độ nhưng so với mẫu chuẩn (đường phân tích nhiệt vi phân). Đường này cho biết hiệu ứng nào là hiệu ứng thu nhiệt, hiệu ứng nào là hiệu ứng tỏa nhiệt. Hiệu ứng thu nhiệt ứng với pic cực tiểu, hiệu ứng tỏa nhiệt ứng với pic cực đại trên đường DTA.
Đường TGA (đường phân tích trọng lượng nhiệt) cho biết biến thiên khối lượng của mẫu nghiên cứu trong quá trình đun nóng. Nhờ đường này có thể suy luận thành phần của phức chất căn cứ vào độ giảm của khối lượng khi xảy ra các hiệu ứng nhiệt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Dựa vào phương pháp phân tích nhiệt, cho phép chúng ta thu được những dữ kiện về tính chất của phức rắn như:
Độ bền nhiệt của phức và các yếu tố ảnh hưởng tới độ bền nhiệt.
Xác định được phức có chứa nước hay không chứa nước, đó là nước phối trí hay nước kết tinh. Phức chứa nước thì hiệu ứng mất nước là hiệu ứng thu nhiệt. Nhiệt độ của hiệu ứng mất nước kết tinh thường thấp hơn nhiệt độ của hiệu ứng mất nước phối trí.
Hiện tượng đồng phân hình học, hiện tượng đa hình của phức thường kèm theo hiệu ứng tỏa nhiệt [5].
1.5.2. Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại
Phổ hấp thụ hồng ngoại là phương pháp vật lý hiện đại cho nhiều thông tin quan trọng về thành phần và cấu tạo của phức chất [8].
Cơ sở của phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại là: chiếu mẫu nghiên cứu bằng bức xạ hồng ngoại có thể làm dịch chuyển mức năng lượng dao động quay của các phân tử. Mỗi nhóm nguyên tử trong phân tử được đặc trưng bằng một số dải hấp thụ nhất định trong phổ hồng ngoại. Do ảnh hưởng của các nhóm khác nhau trong phân tử, các dải hấp thụ thuộc nhóm đang xét sẽ bị dịch chuyển về vị trí hay thay đổi về cường độ. Dựa trên chiều hướng dịch chuyển, mức độ thay đổi vị trí các dải hấp thụ có thể thu được những thông tin quan trọng về cấu tạo của các hợp chất.
Khi phối tử tham gia vào cầu phối trí của phức chất thì phổ hấp thụ hồng ngoại của chúng bị thay đổi, sự thay đổi này có liên quan đến sự thay đổi kiểu liên kết giữa ion kim loại và phối tử. Để phát hiện kiểu thay đổi đó, người ta so sánh phổ hấp thụ hồng ngoại của những hợp chất chứa phối tử mà các dạng liên kết trong những hợp chất này đã được xác định rõ. Việc nghiên cứu phức chất bằng phương pháp này còn cho biết kiểu liên kết trong phức chất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Việc gán ghép các dải hấp thụ được thực hiện trên cơ sở tính toán các dao động chuẩn (đối xứng hoặc bất đối xứng) của các nhóm nguyên tử. Để nhận biết các nhóm nguyên tử hoặc các nhóm đặc trưng trong phân tử hợp chất nghiên cứu, tra bảng các tần số đặc trưng trong tài liệu tra cứu.
Việc phân tích phổ hồng ngoại của các phức aminoaxit với kim loại không phải dễ dàng. Bởi sự hấp thụ của nhóm amin bị xen phủ bởi sự hấp thụ của nhóm nước kết tinh, còn tần số dao động của nhóm - COO-
thì không những chịu ảnh hưởng của sự tạo phức mà còn chịu ảnh hưởng của liên kết
hiđro giữa nhóm -C=O với nhóm -NH2 của phân tử khác. Mặt khác tần số dao
động bất đối xứng của nhóm - COO-
và tần số dao động biến dạng của nhóm
NH2 trong phức của amino axit cùng nằm trong vùng gần 1600 cm-1 càng làm
khó khăn cho việc qui gán các tần số hấp thụ. Do đó việc gán các dải hấp thụ cho các dao động xác định nhiều khi không thống nhất [5].
1.5.3. Phương pháp đo độ dẫn điện
Đây cũng là phương pháp thuận tiện, được áp dụng rộng rãi để nghiên cứu phức chất. Nguyên tắc của phương pháp là: xác lập một số trị số trung bình mà độ dẫn điện mol(μ) hoặc độ dẫn điện đương lượng (λ) của dung dịch phức chất dao động xung quanh chúng. Các giá trị này sẽ đặc trưng cho tính chất điện li của các phân tử phức chất trong dung dịch.
Khi nghiên cứu phức chất bằng phương pháp này, trước tiên ta xác định độ dẫn điện riêng χ của dung dịch cần nghiên cứu ở một nhiệt độ nhất định, từ đó ta tính được độ dẫn điện mol phân tử μ hoặc độ dẫn điện đương lượng λ.
Đo độ dẫn điện mol là độ dẫn điện của dung dịch chứa một mol hợp
chất phức chất, đặt giữa hai điện cực song song cách nhau 1 cm. Còn gọi là độ dẫn điện mol phân tử và được tính theo công thức:
= .1000
M
C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Độ dẫn điện đương lượng λ (Ω-1
.cm2. đlg-1) tính theo công thức: λ = .1000 N C (Ω-1.cm2. đlg-1 ) Trong đó:
: độ dẫn điện riêng của dung dịch (Ω-1.cm-1) CM : nồng độ mol/l của dung dịch (M)
CN: nồng độ đương lượng của dung dịch (N)
Nhờ phép đo độ dẫn điện dung dịch có thể tìm được số lượng ion mà phức chất phân li ra, từ đó giới hạn số lượng công thức giả định khi nghiên cứu cấu trúc của một phức chất mới.
Khi áp dụng các định luật đặc trưng của chất điện li mạnh thông thường cho phức chất có sự tương ứng gần đúng là cùng nồng độ dung dịch 10-3mol/l ở 250C những phức chất phân li thành hai ion trong dung dịch sẽ có độ dẫn điện mol gần 100 (Ω-1
.cm2.mol-1), những phức chất phân li thành 3, 4 và 5 ion sẽ có độ dẫn điện mol khoảng 250, 400 và 500 ( Ω-1
.cm2.mol-1). Đối với phức chất có bản chất trung hoà điện thì độ dẫn điện rất bé [9].
Độ dẫn điện của dung dịch phức chất phụ thuộc vào các yếu tố sau:
Bản chất của ion trung tâm
Bản chất của phối tử
Cấu tạo của ion phức
Dung lượng phối trí của các phối tử
Các phức chất mà phân tử của chúng có các vòng 5 hoặc 6 cạnh đều rất bền. Vì vậy độ dẫn điện của dung dịch của chúng thực tế không thay đổi theo thời gian và nhỏ hơn độ dẫn điện của dung dịch phức chất không vòng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Dựa theo kết quả đo độ dẫn điện ở một chừng mực nào đấy có thể suy đoán về độ bền tương đối của các phức chất có cùng kiểu cấu tạo với nhau. Đối với các phức chất có cùng kiểu cấu tạo thì dung dịch của phức chất nào có độ dẫn điện lớn hơn sẽ kém bền hơn [9].
1.6. Đối tƣợng thăm dò hoạt tính sinh học của phức chất
1.6.1 Giới thiệu về vi khuẩn Salmonella và E.coli
Vi khuẩn (bacterium, bacteria) đôi khi còn được gọi là vi trùng, nó thuộc loại ký sinh trùng. Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước nhỏ và thường có cấu trúc tế bào đơn giản không có nhân, bộ khung tế bào và các bào quan như ty thể và lục lạp.
* Salmonella là loại trực khuẩn gram âm, có lông, có sức đề kháng tốt ở ngoại cảnh. Trong đất sống được vài tháng, trong nước sống được vài tuần, trong thực phẩm đông lạnh được 2 - 3 tháng và sống cả ở những thực phẩm có nồng độ muối cao, ở 1000oC phải hơn 5 phút mới diệt được.
*Vi khuẩn E.coli thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc. Chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng.
- E.coli là loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế
bào, kích thước trung bình 2- 3µm x 0,5 µm; trong những điều kiện không thích hợp vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E. coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông . E. coli Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường ở nhiệt độ từ 5- 40oC, pH 7,4.Trong những điều kiện thích hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình1.1. Hình thái vi khuẩn Salmonella Hình 1.2. Hình thái vi khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn có thể có ích hoặc có hại cho môi trường, động vật, cả con người. Vai trò của vi khuẩn trong gây bệnh và truyền bệnh rất quan trọng. Một số là tác nhân gây bệnh (pathogen) và gây ra bệnh uốn ván (tetanus), sốt thương hàn (typhoid fever), giang mai (syphilis), tả (cholera), bệnh lây qua thực phẩm (foodborne illness) và lao (tuberculosis). Ở thực vật, vi khuẩn gây mụn lá, và héo cây. Các hình thức lây nhiễm gồm qua tiếp xúc,
không khí, thực phẩm, nước và côn trùng [11].
E. coli cũng là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E. coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương.
Vi khuẩn E.coli nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật. Chúng trở nên gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chúng.
Salmonella thường vào cơ thể qua đường ăn uống, salmonella truyền sang người do ăn phải đồ ăn nhiễm vi khuẩn salmonella. Vi khuẩn salmonella có thể nhiễm gẩn như bất cứ loại thức ăn nào, như trứng tươi, sản phẩm trứng, rau tươi, ngũ cốc và nước .. khuẩn Salmonella có thể gây tiêu chảy, viêm đường ruột, hoặc nặng hơn nữa là bệnh thương hàn. nhiễm khuẩn máu, viêm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ruột. Bệnh thương hàn có triệu chứng ban đầu là sốt kèm theo lạnh run, sốt tăng dần kéo dài trong 2 tuần, gây ra suy nhược, biếng ăn, mệt mỏi, gan lách to, xuất huyết ngoài da, lượng bạch cầu giảm. Có thể nói đây là một trong các bệnh có nhiều biến chứng nguy hiểm nhất trong số các bệnh lây truyền qua đường tiêu hóa.
Trong đề tài này, chúng tôi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của phức chất tổng hợp được đối với hai loại vi khuẩn là Salmonella và E.coli.
1.6.2 Giới thiệu về cây lạc, protein, proteaza và α-amilaza
1.6.2.1 Vài nét về cây lạc
Lạc (danh pháp khoa học: Arachis hypogaea ) hay còn gọi là đậu phộng
hay đậu phụng, là một loài cây thực phẩm thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Trung và Nam Mỹ. Trong số các loại cây có dầu ngắn ngày, cây lạc đứng thứ hai sau đậu tương về diện tích cũng như sản lượng. Ở Việt Nam, hiện nay lạc là một trong các mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng, đem lại thu nhập nhanh cho nông dân và là nguồn thu ngoại tệ cho đất nước. Toàn bộ diện tích trồng lạc trong năm 2011 ước tính đến 50.000 ha [11].
Một số đặc điểm về cây lạc: - Rễ: rễ chùm.
- Thân: thân thảo, cao từ 3-50 cm.
- Lá: Lá mọc đối, kép hình lông chim với bốn lá chét, kích thước lá chét dài 1-7 cm và rộng 1-3 cm.
- Hoa: Hoa dạng hoa đậu điển hình màu vàng có điểm gân đỏ, cuống
hoa dài 2-4 cm.
- Quả: Sau khi thụ phấn, quả phát triển thành một dạng quả đậu dài 3-7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Lạc là cây thực phẩm rất giàu năng lượng vì hạt lạc chứa 32-55% lipit,16-34% protein, 13,3% gluxit, các axit amin, canxi, phốt pho, sắt,... Theo nghiên cứu, các chất trong hạt lạc có tác dụng phòng ngừa lão hoá phòng ngừa bệnh xơ cứng động mạch và bệnh ở mạch vành tim, thúc đẩy tế bào não phát triển, giúp phát triển trí tuệ của trẻ em, làm giảm cholesterol trong máu, Màng bọc ngoài (vỏ lụa) của nhân lạc có tác dụng cầm máu tốt. Trong vỏ cứng của củ lạc có chất luteolin có tác dụng hạ huyết áp, hạ mỡ máu, ngăn chặn sỏi mật, tăng cường trí nhớ và sức khỏe não, Chất teta-sitoserol (Sit) có trong dầu lạc có tác dụng chống lại bệnh ung thư bằng cách ngăn chặn sự phát triển của các tế bào.
Cây lạc được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới: Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ…Châu Á đứng đầu thế giới cả về diện tích và sản lượng (chiếm 60% diện tích trồng và 70% sản lượng của thế giới)
1.6.2.2. Giới thiệu về protein, proteaza và α-amilaza
* Protein: là các polime có khối lượng phân tử lớn, chủ yếu bao gồm các L-amino axit kết hợp với nhau qua liên kết peptit. Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sinh vật nhưng lại có tính đặc thù