DNA ựược chiết từ các mẫu vi sinh vật nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987). DNA ựược hòa trong 50 uL ựệm TE và bảo quản ở -20 OC.
Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) ựã ựược sử dụng ựể nhân toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm. Hai Mồi Phy1F và Phy1R (Hà Viết Cường và cộng sự, 2010) ựược dùng ựể nhân 1 ựoạn ~ 800 bp từ vùng mã hóa 16S RNA ribosome của vi khuẩn
Phản ứng PCR ựược thực hiện với DreamTaq polymerase của hãng Fermentas với nhiệt ựộ gắn mồi ở 500C.
Sản phẩm PCR ựược tinh chiết từ gel agarose dùng kắt tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA ựược ước lượng nồng ựộ bằng ựiện di agarose. Sản phẩm PCR ựược giải trình tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR và kắt BigDyeệ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR. Sản phẩm giải trình tự ựược tinh chiết, làm khô và gửi ựọc tại Viện
Công nghệ sinh học tại Hà Nội. Trình tự nucleotide ựược biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene).
Phân tắch trình tự
Dựa trên các trình tự thu ựược, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập nấm F. oxysprum từ mẫu dưa chuột bị bệnh héo vàng
3.1.1. Thu thập mẫu dưa chuột bị bệnh héo vàng, phân lập nấm F. oxysprum oxysprum
Chúng tôi ựã tiến hành thu thập các mẫu thân cây dưa chuột bị bệnh và ựất vùng cây bị bệnh từ các Hà Nội, Vĩnh Phúc
Bảng 3.1. Phân lập nấm Fusarium oxysporum từ mẫu cây dưa chuột bị bệnh héo vàng
địa ựiểm thu mẫu Cây trồng Số mẫu phân lập
Số mẫu xuất hiện
F. oxysporum
Tỷ lệ %
Vĩnh Phúc Dưa chuột 20 15 75
đông Anh - HN Dưa chuột 20 12 60
Tổng số mẫu phân lập 40 27 67,5
Kết quả cho thấy trong 40 mẫu bệnh ựược phân lập có 27 mẫu có sự xuất hiện nấm F. oxysporum, chiếm tỉ lệ 67,5%. Các dòng nấm phân lập ựược sẽ ựược làm thuần, tách ựơn bào tử và bảo quản ựể phục vụ cho các thắ nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1 Phân lập nấm F.oxysprum từ thân cây cây dưa chuột sau 10 ngày lây bệnh
3.1.2. Xác ựịnh tác nhân gây bệnh héo vàng dưa chuột qua lây bệnh nhân tạo lại ựối với dưa chuột tạo lại ựối với dưa chuột
Các dòng nấm sau khi ựược phân lập ựã lây bệnh nhân tạo trên cây dưa chuột trong nhà lưới. Kết quả thắ nghiệm ựược thể hiện trong bảng 2.
Bảng 3.2. Kết quả lây bệnh nhân tạo nấm F. oxysporum
trên cây dưa chuột
Cây trồng
Mật ựộ bào tử
/ml
Số cây xuất hiện triệu chứng sau lây bệnh Tỷ lệ (%) Dưa chuột - 20 cây lây bệnh
- 20 cây ựối chứng (nước cất)
104 - 17 0 85 0 Tỉ lệ cây bị bệnh thu ựược ở dưa chuột là 85%. Các cây ở công thức ựối chứng phát triển bình thường, không có triệu chứng vàng lá hay héo cây. Sau lây bệnh 40 ngày
Bảng 3.3. Kết quả phân lập lại mẫu thân cây dưa chuột bị héo vàng do lây bệnh nhân tạo
Mẫu thân cây bị bệnh
Số mô phân lập
Số mô xuất hiện nấm
Fusarium oxysporum Tỷ lệ (%)
Dưa chuột 40 40 100
3.2. Thu thập vi khuẩn, xạ khuẩn ựối kháng nấm F. oxysporum gây bệnh héo vàng dưa chuột. héo vàng dưa chuột.
3.2.1. Phân lập VK, XK ựối kháng
Các dòng VSV ựã ựược thu thập trong ựất tại các vườn hay các vùng trồng dưa chuột bị bệnh, Sau khi thu thập, các dòng VSV ựược tách dòng thuần và thử khả năng ựối kháng trên môi trường bằng phương pháp cấy ựối
xứng với hai dòng nấm F. oxysporum FH0 và FH1 gây bệnh cây dưa chuột.
Bảng 3.4. Phân lập và thử nghiệm khả năng ựối kháng của các dòng VSV với nấm F. oxysporum
Khả năng ựối kháng địa ựiểm
thu mẫu Cây trồng
Số mẫu phân lập Số dòng VSV phân lập ựược +++ ++ + Vĩnh Phúc Dưa chuột 20 3 0 0 3 Dưa chuột 20 12 0 5 7 đông Anh - HN Dưa chuột 20 10 1 0 9 Tổng số 60 25 1 5 19 Ghi chú: + đường kắnh vòng ức chế từ 1-5 mm ++ đường kắnh vòng ức chế từ 6-10 mm
+++ đường kắnh vòng ức chế >10 mm (Kui Ja lee và cộng sự., 2008) Chúng tôi ựã ựược phân lập từ 60 mẫu ựất thu thập tại các tỉnh Hà nội và Vĩnh phúc. Sau khi ựược làm thuần, các dòng vi khuẩn này ựược thử nghiệm khả năng ựối kháng với nấm F. oxysporum và kết quả cho thấy chỉ có 1 dòng và kế thừa 9 dòng có khả năng cao trong việc hạn chế sự phát triển của nấm F. oxysporum (ựường kắnh ức chế >10 mm)
3.2.2. Khả năng ựối kháng của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng. vọng.
a. Trong phòng thắ nghiệm
Sau khi ựã có những kết quả ban ựầu về khả năng ựối kháng, 1 dòng vi khuẩn và xạ khuẩn ựã ựược tuyển chọn và xác ựịnh rõ hơn về khả năng ựối kháng nấm F. oxysporum bằng hai phương pháp cấy ựối xứng và phương pháp giếng. Kết quả thắ nghiệm cho thấy các dòng vi khuẩn hay xạ khuẩn có triển vọng ựều có khả năng hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm F.
oxysporum ở cả 2 phương pháp cấy ựối xứng và phương pháp giếng . Ở phương pháp cấy ựối xứng, 10 dòng vi khuẩn, xạ khuẩn ựều có khả năng như nhau (ựường kắnh ức chế không sai khác có ý nghĩa) hạn chế sự sinh trưởng của nấm gây hại. Các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn này hạn chế từ 79,4 ựến 86,7% sự phát triển của nấm gây hại dưa chuột, trong ựó hiệu quả ức chế cao nhất là các dòng vi khuẩn VF7 và dòng xạ khuẩn F123. Ở phương pháp giếng, các dòng vi khuẩn hay xạ khuẩn cũng có hiệu quả cao hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm F. oxysporum hại dưa chuột với ựường kắnh vòng ức chế ựều >10mm.
Bảng 3.5. Khả năng ựối kháng của các dòng VSV có triển vọngvới nấm F.
oxysporum gây bệnh héo vàng dưa chuột theo phương pháp cấy ựối xứng
đường kắnh tản nấm F.
oxysporum sau 7 ngày (cm) HQƯC (%)
4 FH13 FH1 TT Ký hiệu nguồn1 Giống VSV2 CT5 đC6 1 F29.1 VK 1,47 9,0 84,0 2 F90.1 VK 1,67 9,0 81,4 3 F97.5 VK 1,85 9,0 79,4 4 F100.5 VK 1,79 9,0 80,1 5 F116 VK 1,82 9,0 79,8 6 VF6 VK 1,57 9,0 82,6 7 VF7 VK 1,20 9,0 85,7 8 F112 XK 1,35 9,0 85,0 9 F123 XK 1,20 9,0 86,7 10 F129 XK 1,51 9,0 83,2 LSD 0.05 0,62 CV(%) 3,2
Ghi chú:
(1). Các dòng VSV ựối kháng có triển vọng ựược mã hóa.
(2). VK hay XK là vi khuẩn hay xạ khuẩn ựược xác ựịnh căn cứ vào ựặc ựiểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng ựặc hiệu.
(3). Dòng nấm F. oxysporum gây bệnh trên dưa chuột.
(4). Hiệu quả ức chế nấm F.oxysporum của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA.
(5). Vi khuẩn hay xạ khuẩn và nấm F. oxysporum cùng nuôi cấy trên môi trường PDA.
(6). Nấm F. oxysporum nuôi cấy ựơn lẻ trên môi trường PDA.
Kết quả trên cho thấy dòng vi khuẩn hay xạ khuẩn có triển vọng ựều có khả năng hạn chế sự sinh trưởng phát triển của nấm F. oxysporum ở cả phương pháp cấy ựối xứng và phương pháp giếng. Ở phương pháp cấy ựối xứng, 10 dòng vi khuẩn, xạ khuẩn ựều có khả năng như nhau (ựường kắnh ức chế không sai khác có ý nghĩa) hạn chế sự sinh trưởng của nấm hại. đường kắnh tản nấn F.oxysporum ở các công thức cấy cùng, vi khuẩn, xạ khuẩn từ 1,20- 1,85 cm, trong khi ở công thức ựối chứng là 9,0cm. Các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn này hạn chế từ 79,4- 86,7% sự phát triển của nầm F. oxysporum gây hại dưa chuột, trong ựó hiệu quả ức chế cao nhất là các dòng vi khuẩn VF7 và dòng xạ khuẩn F123.
Bảng 3.6. Khả năng ựối kháng của các dòng VSV có triển vọng với nấm
F. oxysporum gây bệnh héo vàng cây dưa chuột theo phương pháp giếng
FH13 TT Ký hiệu nguồn1 Giống VSV2 đường kắnh vòng ức chế (cm) Khả năng ựối kháng 1 F29.1 VK 2,75 +++ 2 F90.1 VK 2,03 +++ 3 F97.5 VK 1,97 +++ 4 F100.5 VK 2,22 +++ 5 F116 VK 2,05 +++ 6 VF6 VK 2,33 +++ 7 VF7 VK 2,15 +++ 8 F112 XK 3,01 +++ 9 F123 XK 2,92 +++ 10 F129 XK 2,22 +++ Ghi chú:
(1). Các dòng VSV ựối kháng có triển vọng ựược mã hóa.
(2). VK hay XK là vi khuẩn hay xạ khuẩn ựược xác ựịnh căn cứ vào ựặc ựiểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng ựặc hiệu.
(3). Dòng nấm F. oxysporum gây bệnh trên dưa chuột.
Kết quả trên thể hiện khả năng ức chế nấm F. oxysporum của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn ựối kháng theo phương pháp giếng, cũng tương tự như ở phương pháp ựĩa agar, các dòng vi khuẩn hay xạ khuẩn cũng có hiệu quả cao hạn chế sự sinh trưởng phát triển của nấm F. oxysporum hại dưa chuột với ựường kắnh vòng ức chế ựều > 10mm.
Hình 3.2. đối kháng của một số dòng vi khuẩn, xạ khuẩn với nấm
Fusarium oxysporum theo phương pháp giếng
b. Trong nhà lưới
Sau khi ựã có kết quả trong phòng thắ nghiệm, 10 dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng ựược thử nghiệm khả năng ựối kháng nấm F. oxysporum
gây hại cây dưa chuột trong nhà lưới. Cây dưa chuột giai ựoạn 2-3 lá thật ựược trồng trong chậu ựất có xử lý hỗn hợp dung dịch vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm F. oxysporum.
Mật ựộ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm F. oxysporum gây hại trên cây dưa chuột ựược thu thập và phân tắch trong phòng thắ nghiệm
Bảng 3.7. Biến ựộng quần thể của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn trong ựiều kiện nhà lưới
TT Công thức Mật ựộ bào tử (x109)/g ựất3 10 NST 20 NST 30NST 1 F29.11 2,0 6,8 328 2 F90.1 6,8 31,2 252 3 F97.5 8,4 46 488 4 F100.5 13,2 32,4 712 5 F116 3,6 13,2 308 6 VF6 4,8 10,8 540 7 VF7 10,8 26 488 8 F112 6,0 48,8 380 9 F123 4,0 30,8 500 10 F129 3,6 13,6 340 Ghi chú:
(3). Mật ựộ bào tử nấm xử lý trong ựất là 1 x 103 trước khi trồng dưa chuột Kết quả trình bày ở Bảng 3.7 cho thấy mật ựộ bào tử của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn tăng mạnh theo thời gian. Sau 30 ngày mật ựộ bào tử của các dòng vi khuẩn có thể tăng rừ 3,0 x 109 ựến 328 x 109 bt/g ựất (gấp 37,0 lần) ở dòng F90.1 và tăng 125 lần ở dòng xạ khuẩn F123 . Sự tăng mạnh số lượng bào tử trong ựất cùng với khả năng ức chế ựã hạn chế sự gia tăng quần thể của dòng nấm FH1 gây hại dưa chuột
Bảng 3.8. Biến ựộng quần thể của nấm F. oxysporum gây bệnh héo vàng cây dưa chuột trong ựiều kiện nhà lưới
TT Công thức Mật ựộ bào tử nấm FH1 (x103)/g ựất3 10 NST 20 NST 30NST 1 F29.11 16 4,8 0,04 2 F90.1 8,0 3,6 0,02 3 F97.5 2,0 2,0 0,08 4 F100.5 6,0 5,6 0,04 5 F116 2,8 2,0 0,04 6 VF6 7,0 2,0 0,01 7 VF7 5,2 4,0 0,02 8 F112 2,0 1,0 0,03 9 F123 3,0 1,6 0,009 10 F129 3,2 1,0 0,008 Ghi chú:
(3). Mật ựộ bào tử nấm xử lý trong ựất là 1 x 103 trước khi trồng dưa chuột Số liệu Bảng 3.8 cho thấy sau 30 ngày mật ựộ bào tử của nấm
Fusarium giảm ựáng kể trong ựất trồng dưa chuột có xử lý các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn. Mật ựộ bào tử nấm F. oxysporum dòng FH1 trong ựất trồng dưa chuột có thể giảm từ 3,0 x 103 xuống 0,009 bt/g ựất ( Giảm 333 lần) sau 30 ngày.
Bảng 3.9. Hiệu quả của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng có triển vọng với héo vàng dưa chuột trong nhà lưới
Tỷ lệ cây bị bệnh (%) TT Công thức
10 ngày 20 ngày 30 ngày
HQGB (%) sau 30 ngày 1 đối chứng 1 0,0 0,0a 0,0a - 2 F29.1 0,0 9.8d 24,0d 56,9 3 F90.1 0,0 10,5d 23,2d 58,0 4 F97.5 0,0 11,2d 24,5d 56,0 5 F100.5 0,0 8,7bc 18,9b 66,1 6 F116 0,0 8,2b 18,5b 66,8 7 VF6 0,0 10,5c 24,4 56,2 8 VF7 0,0 8,8bc 20,7bc 62,8 9 F112 0,0 8,5b 19,5b 65,0 10 F123 0,0 7,8b 20,5b 63,0 11 F129 11,0d 24,0d 56,9 12 đối chứng 22 5,2 23,5e 55,7e - CV(%) 33,2 28,5 21,7
Kết quả cho thấy, cả 10 nguồn vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng ựều có khả năng ức chế nấm F. oxysporum gây bệnh héo vàng dưa chuột trong ựiều kiện nhà lưới, hiệu quả giảm bệnh sau 30 ngày ựạt từ 56 ựến 66,8%. Các dòng có triển vọng nhất là F112, F123 khi chúng có thể hạn chế từ 63 ựến 66,8% sự gây hại của nấm F. oxysporum.
3.3. Nghiên cứu ựặc ựiểm sinh lý và sinh hóa của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng. khuẩn có triển vọng.
3.3.1. Xác ựịnh tắnh yếm khắ
Bảng 3.10. đặc tắnh yếm khắ của các nguồn VK, XK triển vọng
TT Ký hiệu nguồn VK, XK Tắnh yếm khắ Phản ứng chuyển màu 1 F29.1 VK + Xanh sang vàng 2 F90.1 VK + Xanh sang vàng 3 F97.5 VK + Xanh sang vàng 4 F100.5 VK + Xanh sang vàng 5 F116 VK + Xanh sang vàng 6 VF6 VK + Xanh sang vàng 7 VF7 VK + Xanh sang vàng 8 F112 XK + Xanh sang vàng 9 F123 XK + Xanh sang vàng
10 F129 XK - Không chuyển màu
Ghi chú:
+: Có tắnh kỵ khắ -: Hiếm khắ bắt buộc
Trong số 10 nguồn VK, XK có triển vọng ựối kháng, chỉ có một nguồn F129 là không có phản ứng chuyển màu, tức là XK này thuộc nhóm hiếu khắ bắt buộc. Dịch cấy các nguồn còn lại ựều chuyển màu, như vậy 9 nguồn còn lại thuộc nhóm kỵ khắ không bắt buộc, có khả năng sinh trưởng, phát triển trong ựiều kiện có không khắ và không có không khắ.
Hình 3.3.Khả năng yếm khắ của một số dòng VK, XK
3.3.2. Xác ựịnh khả năng khử Nitrat
Bảng 3.11. Khả năng khử Nitrat của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
TT Ký hiệu nguồn VK, XK Khả năng khử Nitrat
1 F29.1 VK + 2 F90.1 VK + 3 F97.5 VK + 4 F100.5 VK + 5 F116 VK + 6 VF6 VK + 7 VF7 VK + 8 F112 XK + 9 F123 XK + 10 F129 XK + Ghi chú: +: Có khả năng khử Nitrat
Kết quả thắ nghiệm cho thấy cả 10 nguồn VK, XK ựều có khả năng khử Nitrat
Hình 3.4.Khả năng khử nitrat của một số dòng VK, XK
3.3.3.Khả năng ựồng hóa nguồn Cacbon
Bảng 3.12. Khả năng ựồng hóa nguồn cac bon của các nguồn VK, XK triển vọng
Nguồn cac bon TT Ký hiệu
nguồn VK, XK Glucose Saccarose Tinh bột Manitol
1 F29.1 VK + + - + 2 F90.1 VK + + - + 3 F97.5 VK + + - + 4 F100.5 VK + + + + 5 F116 VK + + + + 6 VF6 VK + + + + 7 VF7 VK + + - + 8 F112 XK + - - - 9 F123 XK + - - 10 F129 XK + - - -
Ghi chú: +: Có khả năng ựồng hóa -: Không có khả năng ựồng hóa
Trong số các nguồn cacbon thắ nghiệm, cả 10 dòng VK, XK ựều có khả năng ựồng hóa ựường Glucose. 8 dòng có khả năng ựồng hóa ựường Saccarose (2 dòng F112 và F129 không có khả năng ựồng hóa ựường Saccarose). Với tinh bột, Chỉ có 3 dòng là F100.5; F116 và VF6 là có khả năng ựồng hóa. Có 7 dòng có khả năng ựồng hóa rượu Manitol, 3 dòng không có khả năng ựồng hóa rượu manitol là F112; F123 và F129.
Nguồn C từ Glucose Nguồn C từ Saccarose
Nguồn C từ Manitol Nguồn C từ tinh bột tan
Hình 3.5.Khả năng ựồng hóa nguồn cac bon của các nguồn VK, XK triển vọng
3.3.4. Tắnh chịu muối (NaCl) của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn triển vọng.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng ựộ muối ựến sinh trưởng, phát triển của các nguồn VK, XK triển vọng
Số khuẩn lạc VK, XK sau 7 ngày nuôi cấy
Vi khuẩn Xạ khuẩn Công thức F29.1 F90.1 F97.5 F100.5 F116 VF6 VF7 F112 F123 F129 NaCl 1% 171,6e 20,9 44,0e 118,0e 40,0d 56,5d 33,8d 88,6c 67,0c 138,6c NaCl 3% 41,9c 13,9 32,1c 35,5c 35,8b 45,1b 22,8b 78,8b 55,4b 125,5b NaCl 5% 22,0b 7,5 20,5b 10,8b 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a NaCl 7% 0,0a 0,0 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a