tỉnh Hà Nội và Vĩnh Phúc và phân lập nguồn nấm Fusarium gây bệnh héo vàng dưa chuột, nguồn VSV (vi khuẩn, xạ khuẩn) ựối kháng
- Chẩn ựoán và giám ựịnh VSV ựối kháng bằng phương pháp sinh học phân tử
- Nghiên cứu ựánh giá khả năng ựối kháng của các VSV với nấm F. oxysporum gây bệnh héo vàng dưa chuột trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm và nhà lưới.
- Nghiên cứu các ựặc ựiểm sinh lý, sinh hóa của các dòng VSV ựối kháng. - Ảnh của một số yếu tố (môi trường, pH, nhiệt ựộ) ựến khả năng nhân sinh khối của VSV ựối kháng
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. điều tra, thu thập nguồn nấm Fusarium gây bệnh, nguồn vi sinh vật (VSV) ựối kháng: (VSV) ựối kháng:
- Phương pháp ựiều tra: điều tra theo 5 ựiểm chéo góc, mỗi ựiểm 20 cây - Phương pháp thu mẫu bệnh hại: Thu những mẫu bệnh mới xuất hiện triệu chứng, ựiển hình, mẫu phải ựược bảo quản trong lạnh trước khi phân lập, giám ựịnh
2.4.2. Phương pháp phân lập nấm Fusarium gây bệnh héo rũ cây dưa chuột: chuột:
dòng nước chảy liên tục. Sau ựó ựược khử trùng bằng côn 70% trong 1 phút. Thấm khô trên giấy thấm ựã khử trùng hoặc hơ khô trên ngọn lửa ựèn cồn. Dùng dao ựã vô trùng cắt ngang thân thành những miếng cấy dày khoảng 1 -2 mm tại ựiểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe. Các miếng thân, rễ này ựược cấy trên ựĩa petri có môi trường 1/4 PDA (Khoai tây: 62.5g; dextrose 5g; agar: 20g, bổ sung Streptomycin 0,16g + Neomycin 0,06). Sau khi cấy xong, úp ngược các ựĩa petri ựể tránh ựọng hơi nước trên bề mặt môi trường nuôi cấy và ựặt trong tủ ựịnh ôn 28oC. Khi sợi nấm phát triển dài cách mô bệnh 1 - 2 cm, cấy truyền nấm sang môi trường dinh dưỡng PDA và ựặt các ựĩa này trong tủ ựịnh ôn ở 28oC (Burgess L.W., 2009).
2.4.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
Nấm F. oxysporum ựược nhân nuôi thuần trên môi trường PDA ở nhiệt ựộ 280C. Sau 7 ngày dùng slide ựã khử trùng cạo nhẹ trên bề mặt ựể thu sợi nấm. Dung dịch nấm ựược pha loãng tới nồng ựộ 1x104 bào tử/ml và ựược sử dụng là dịch lây nhiễm. Hạt dưa chuột ựược trồng trong khay nhựa. Khi cây ựược 3-4 lá thật thì nhổ nhẹ cây, rửa sạch bộ rễ và ngâm trong dung dịch lây nhiễm nêu trên trong 20 phút. Sau ựó các cây lây nhiễm ựược trồng trong chậu nhựa có chứa 2 kg ựất khử trùng. Rễ cây nhúng trong nước cất khử trùng ựược sử dụng là công thức ựối chứng. Toàn bộ cây thắ nghiệm ựược tưới nước thường xuyên trong ựiều kiện nhiệt ựộ từ 25-280C. điều tra ựánh giá bệnh sau 10, 20 và 30 ngày sau lây bệnh nhân tạo. Sử dụng thang bệnh 3 cấp, trong ựó cấp 0: cây không bị bệnh, cấp 1: cây bị bệnh nhẹ, gân lá có màu vàng nhưng lá không biến vàng, cấp 2: cây bị bệnh trung bình, lá biến vàng, cấp 3: cây bị bệnh nặng, lá rụng và cây bị héo chết.
Chỉ tiêu theo dõi
Số cây bị bệnh
Tỉ lệ bệnh (%) = x 100 Tổng số cây lây bệnh
n1 + 2n2 + 3n3
Chỉ số bệnh (%) = x100 N x 3
Trong ựó: n1, n2 và n3: Số cây bị bệnh tại từng cấp bệnh tương ứng N: tổng số cây ựiều tra
- Phương pháp tắnh mật ựộ bào tử
Rót 10ml nước cất khử trùng vào hộp petri có nấm F. oxysporum thuần ựược nhân nuôi sau 7 ngày trên môi trường dinh dưỡng PDA ở 280C. Dùng slide khử trùng cạo nhẹ bề mặt thạch và lọc dung dich nấm qua màng lọc. Dùng pipet chuyển dung dịch nấm sang buồng ựếm hồng cầu Neuvour. Mật ựộ bào tử (Bao gồm cả lớn và nhỏ) /ml ựược tắnh theo công thức: A = (n x 10)/4 x D. Trong ựó: A : số bào tử / ml, n: Số bào tử trung bình trong 5 ô ựếm, D: nồng ựộ pha loãng