Mục đích: loại bỏ các Bigdye terminators còn dư và các thành phần dư khác
trong buffer trước khi tiến hành điện di mao quản nhằm thu được tín hiệu tốt hơn trên máy giải trình tự tự động.
Phương pháp: sử dụng nồng độ muối cao trong ethanol tuyệt đối để tủa DNA. Qui trình
- Cho 2 µl EDTA 0,125 M; 2 µl sodium acetate 3 M, 50 µl ethanol 100% và 20 µl sản phẩm sau khi chạy PCR sequecing, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 17000 RPM trong 20 phút.
- Úp ngược để loại dịch nổi, ly tâm 200 RPM trong 1 phút. - Thêm 50 µl ethanol 75%, ly tâm 17000 RPM trong 20 phút. - Úp ngược để loại dịch nổi, ly tâm 200 RPM trong 1 phút.
- Đổ bỏ ethanol dư rồi sấy khô bằng bồn hút chân không trong 10 phút. - Cho 20 µl Hi-di, để 10 phút ở nhiệt độ phòng sau đó đặt vào hệ thống
máy giải trình tự tự động ABI 3130 XL Genetic Analyser. 2.2.3.7 Điện di mao quản DNA
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Nguyên tắc: đoạn DNA mạch đơn được đánh dấu bằng 4 màu huỳnh quang
khác nhau tại đầu 5’ di chuyển trên gel polyacriamide trong quá trình điện di. Các vạch điện di được các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hiệu được mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Tử biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự đoạn DNA [10].
Phương pháp: thực hiện điện đi trên máy giải trình tự ABI 3130 XL Genetic
Analyser (Applied Biosystem, Mỹ) với gel POP-7. 2.2.3.8 Xử lý kết quả giải trình tự
Kết quả được phân tích bằng phần mầm Sequencing analysis, được lưu dưới định dạng fasta và được xử lý bằng phần mềm Bioedit nhằm đưa ra chuỗi trình tự tốt nhất.
Chuỗi trình tự được so sánh với các trình tự tham khảo trên ngân hàng NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov) thông qua công cụ BLAST nhằm xác định chính xác tên vi
khuẩn.
2.2.4 Phương pháp phát hiện vi khuẩn có kiểu hình tiết ESBL 2.2.4.1 Phương pháp đĩa đôi 2.2.4.1 Phương pháp đĩa đôi
Nguyên tắc: dựa vào sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin ở vùng
giao tiếp với đĩa chứa clavulanate khi vi khuẩn có khả năng tiết ESBL.
Tiến hành: lấy vi khuẩn tươi trên hộp thạch MC (cấy không quá 24 giờ) pha
thành dịch huyền phù có McF 0,5 trong nước muối sinh lý. Sau đó dùng tăm bông vô trùng trải đều huyền địch trên môi trường kháng sinh đồ MHA, để khô. Sau đó đặt đĩa kháng sinh Amoxiline/clavulanate (Ac) ở trung tâm và ceftazidime (hoặc cefotaxime) cách Ac 15 mm. Ủ trong điều kiện thích hợp (37oC, 16-18 giờ).
Đọc kết quả: kiểu hình ESBL dương khi có sự xuất hiện hình “cổ chai” do sự
mở rộng vòng vô khuẩn từ đĩa ceftazidime (hoặc cefotaxime) ở vùng giao tiếp với đĩa Amoxiline/clavulanate.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Nguyên tắc: Dựa trên phát hiện tính hiệp lực của đĩa kháng sinh cephalosporin
và cephalosporin + chất ức chế β-lactamase khi thực hiện kháng sinh đồ. Các enzyme ESBL do vi khuẩn sản sinh bị ức chế bởi một số chất ức chế beta-lactamase như acid clavulanic nên môi trường chứa kháng sinh có bổ sung acid clavulanic sẽ ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn sản sinh ESBL mạnh hơn so với môi trường chỉ chứa kháng sinh.
Tiến hành: lấy vi khuẩn tươi trên hộp thạch MC (cấy không quá 24 giờ) pha
thành dịch huyền phù có McF 0,5 trong nước muối sinh lý. Sau đó dùng tăm bông vô trùng trải đều huyền địch trên môi trường kháng sinh đồ MHA, để khô. Sau đó đặt đĩa kháng sinh Ceftazidime và (ceftazidime + acid clavulanic) lên và ủ trong điều kiện thích hợp (37oC, 16-18 giờ).
Đọc kết quả: Sau 16-18 giờ ủ ở 37oC, đo đường kính vòng vô khuẩn. Thử nghiệm sàng lọc ESBL ban đầu dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, các chủng có đường kính vòng vô khuẩn đĩa Ceftazidime ≤ 22 mm có kết quả sàng lọc dương tính. Các chủng được xác định có kiểu hình tiết ESBL khi có kết quả quả sàng lọc dương tính đồng thời có vòng vô khuẩn của đĩa (ceftazidime + acid clavulanic) rộng hơn so với đĩa ceftazidime 5 mm [67, trang 48].
2.2.5 Phương pháp phát hiện vi khuẩn có khả năng sinh carbapenmase 2.2.5.1 Phương pháp khuyếch tán kháng sinh 2.2.5.1 Phương pháp khuyếch tán kháng sinh
Nguyên tắc: khi đặt đĩa kháng sinh trên môi trường đã trải vi khuẩn, kháng sinh
từ đĩa khuếch tán ra môi trường và ức chế sự phát triển của vi khuẩn tạo thảnh vòng vô khuẩn. Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn xung quanh đĩa kháng sinh để biện luận vi khuẩn đề kháng, trung gian hay nhạy cảm theo tiêu chuẩn
Phương pháp: lấy vi khuẩn tươi trên hộp thạch MC (cấy không quá 24 giờ) pha
thành dịch huyền phù có McF 0.5 trong nước muối sinh lý. Sau đó dùng tăm bông vô trùng trải đều huyền địch trên môi trường kháng sinh đồ MHA, để khô. Sau đó đặt đĩa
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP kháng sinh imipenem, meropenem, lên và ủ trong điểu kiện thích hợp (37oC, 16-18 giờ).
Đọc kết quả: đo đường kính vòng vô khuẩn, biện luận theo tiêu chuẩn của CLSI
2011 (Bảng 2.3).
Bảng 2.3 Hướng dẫn biện luận tính kháng của nhóm Enterobacteriacea theo CLSI 2011 [67, trang 45]
Biện luận Tiêu chuẩn
biện luận Kháng sinh
Kháng (R) Trung gian (I) Nhạy (S)
Imipenem (10 µg) ≤ 19 mm 20-22 mm ≥ 23 mm Đường kính vòng vô khuẩn Meropenem (10 µg) ≤ 19 mm 20-22 mm ≥ 23 mm Meropenem ≤ 1 µg/ml 2 µg/ml ≥ 4 µg/ml Doripenem ≤ 1 µg/ml 2 µg/ml ≥ 4 µg/ml MIC Ertapenem ≤ 0,25 µg/ml 0,5 µg/ml ≥ 1 µg/ml
2.2.4.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Phương pháp: vi pha loãng trong môi trường lỏng Cách tiến hành
- Cho 200 µl môi trường lỏng Muller Hinton (MH) vào lọ kháng sinh đông khô (nồng độ 256 µg/ml) và 90 µl MH vào mỗi giếng trong bảng nhựa 12 giếng.
- Cho 90 µl dung dịch kháng sinh vào giếng số 1, trộn đều và pha loãng ½ sang giếng số 2. Thực hiện tương tự cho đến giếng số 11. Giếng số 12 không có kháng sinh nhằm kiểm soát quá trình pha loãng vi khuẩn và bổ sung vi khuẩn.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
- Cho 10 µl dịch huyền phù vi khuẩn đã pha loãng 1/100 vào từng giếng. Riêng giếng số 11 không bổ sung vi khuẩn nhằm kiểm soát quá trình ngoại nhiễm.
- Ủ 37oC/16-20 giờ.
Đọc kết quả: MIC (µg/ml) là giá trị tương ứng với nồng độ kháng sinh trong
giếng mà vi khuẩn bắt đầu không mọc, trong đó giá trị nồng độ kháng sinh trong các giếng như sau:
Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Nồng độ
(µg/ml)
128 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0
Dự vào kết quả MIC vi khuẩn được xác định là kháng, nhạy hay trung gian với carbapenem theo tiêu chuẩn của CLSI 2011 (Bảng 2.2).
2.2.5.3 Thử nghiệm Hodge cải biên
Mục đích: nhằm khẳng định kiểu hình tiết carbapenemase. Đây là thử nghiệm
được đánh giá có độ nhạy rất cao (100%).
Cách tiến hành
- Trải chủng E.coli ATCC ® 25922 nhạy cảm meropenem lên môi trường
kháng sinh đồ MHA.
- Đặt đĩa kháng sinh meropenem lên giữa đĩa thạch.
- Cấy chủng cần kiềm đồng thời với chủng chứng âm K. pneumoniae ATCC ® 1706 và chủng chứng dương K. pneumoniae ATCC ®1705. Đường cấy thẳng
từ đĩa meropenem ra ngoài chu vi đĩa thạch.
- Ủ 37oC/18-24 giờ.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Chủng có tiết carbapenemase có khả năng tăng cường sự tăng trưởng của E.coli
ATCC ® 25922 nên vòng vô khuẩn có hình “cỏ ba lá”. Đối với chủng không tiết carbapenemase thì vòng vô khuẩn có hình tròn (hình 2.2).
Hình 2.2 Thử nghiệm Hodge cải biên trên môi trường MHA [67, trang 52]
Ghi chú: (1) K. pneumoniae ATCC ® 1705.
(2) K. pneumoniae ATCC ® 1706.
(3) Chủng thí nghiệm có MHT dương tính.
2.2.6 Phương pháp xác định vi khuẩn mang gen blaKPC 2.2.6.1 Phương pháp PCR
Dịch ly trích vi khuẩn được bổ sung vào phản ứng PCR khuyếch đại gen blaKPC với các thành phần cho một phản ứng thể tích 50 µl như sau:
PCR buffer 1 X MgCl2 2 mM Tag polymerase 1,25 U dNTP 200 µM mỗi loại Mồi xuôi F 25 pm Mồi ngược R 25 pm
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Mẫu 5 µl
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 2 cặp mồi đều khuyếch đại được đoạn gen blaKPC nhưng với kích thước khác nhau nhằm thu được kết quả tin cậy hơn: cặp mồi blaKPC-F và blaKPC-R khuếch đại đoạn gen blaKPC với độ dài khoảng 400 bp, cặp mồi blaKPCu-F và blaKPCu-R cũng khuếch đại đoạn gen blaKPC nhưng với độ dài lớn hơn (khoảng 533 bp). Trình tự cặp mồi sử dụng được mô tả trong bảng 2.4. Kết quả dương tính khi có cả 2 sản phẩm khuyếch đại ở 2 phản ứng.
Bảng 2.4 Trình tự mồi sử dụng khuyếch đại gen blaKPC
Tên mồi Trình tự Tham khảo
blaKPC-F 5’-TCTGGACCGCTGGGAGCTGG-3’ [22] blaKPC-R 5’-TGCCCGTTGACGCCCAATCC-3’ [22] blaKPCu-F 5’- CAGCTCATTCAAGGGCTTTC-3’ [29] blaKPCu-R 5’- AGTCATTTGCCGTGCCATAC-3’ [29]
Để xác định chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành thử nghiệm hai chương trình luân nhiệt Tm55 và Tm60 với các thông số như trong bảng 2.5.
Bảng 2.5 Chương trình luân nhiệt Tm55 và Tm60
Tm55 Tm60
1 chu kỳ 95oC trong 5 phút 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây
55oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút 3 chu kỳ 72oC trong 10 phút
1 chu kỳ 95oC trong 5 phút 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây
60oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút 3 chu kỳ 72oC trong 10 phút
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Qui trình được thực hiện trên chủng chứng dương K.pneumoniae ATCC ®1705 và chứng âm K.pneumoniae ATCC ® 1706 để kiểm tra điều kiện phản ứng trước khi
áp dụng cho 21 chủng thí nghiệm.
2.2.6.2 Điện di gel agarose
Mục đích: kiểm tra sự có mặt của sản phẩm khuyếch đại của phản ứng PCR. Nguyên tắc: DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường
của bản điện di tùy theo kích thước, những phân tử có kích thước nhỏ sẽ chạy nhanh hơn và xa hơn. Ethidium bromide bổ sung vào gel có khả năng chèn vào các sợi đôi DNA nên có thể phát hiện vạch DNA khuếch đại trên bản điện di dưới ánh sáng UV ở bước sóng 312 nm.
Phương pháp: hỗn hợp 8 µl sản phẩm khuyếch đại PCR và 5 µl dung dịch nạp
mẫu (Bromophenol Blue, Glycerol) nạp vào các giếng trong bảng gel agarose 2% (pha trong TBE 0,5 X) đã bổ sung ethidium bromide 4%, chạy trong thời gian 22 phút, 135 V trong dung dịch đệm TBE 0,5 X.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.2.6.3 Phương pháp giải trình tự gen
Qui trình giải trình tự đoạn gen blaKPC bao gồm các bước
Các phương pháp thực hiện tương tự phương pháp giải trình tự vi khuẩn
- Tinh sạch sản phẩm PCR: sử dụng bộ hóa chất QIAquick PCR Purification Kits (mục 2.2.3.3)
- Xác định nồng DNA bằng DNAchip, phân tích kết quả nhờ hệ thống Aligent 2100 Bioanalyser (mục 2.2.3.4)
- PCR giải trình tự 2 chiều với mồi blaKPC-F và blaKPC-R nhằm thu được đoạn trình tự có độ dài mong muốn.
Thành phần phản ứng PCR giải trình tự
Big dye Terminator 1 µl Big Dye buffer 3,5 µl Mồi (5pmol/µl) 0,7 µl
DNA mẫu từ 13-18 ng
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR giải trình tự
1 chu kỳ 96oC trong 1 phút 25 chu kỳ 96oC trong 10 giây
50oC trong 5 giây 60oC trong 4 phút 1 chu kỳ 4oC trong 10 phút
- Tủa và tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự bằng phương pháp sử dụng nồng độ muối cao trong ethanol tuyệt đối (mục 2.2.3.6).
- Điện di mao quản trên máy giải trình tự tự động ABI 3130XL Genetic Analyser với gel POP-7 (mục 2.2.3.7).
- Kết quả được phân tích bằng phần mầm Sequencing analysis, được lưu dưới định dạng fasta và được xử lý bằng phần mềm Bioedit nhằm đưa ra chuỗi trình tự tốt nhất. Chuỗi trình tự được so sánh với các trình tự tham khảo trên ngân hàng NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov) thông qua công cụ BLAST nhằm xác định chính xác đoạn gen
KPC.
2.2.6.4 Xác định kiểu gen blaKPC
Nguyên tắc: sự khác biệt 1 nucleotide ở gen KPC-2 so với KPC-1 làm cho trình
tự KPC-2 xuất hiện vị trí enzyme cắt giới hạn BstN1. KPC-3 khác KPC-2 ở một nucletide khác nên ở KPC-3 có 2 vị trí nhận biết của 2 enzyme cắt giới hạn BstN1 và RsaI. Dựa vào việc dò tìm vị trí cắt giới hạn của 2 loại enzyme này trong trình tự gen blaKPC thu được ta có thể phân biệt được đó là KPC-1, KPC-2 hay KPC-3 [22].
Phương pháp: sử dụng phần mềm Primer premier 5.0 tìm vị trí cắt giới hạn của
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.3 Qui trình thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành với các bước sau trên tất cả các chủng nghiên cứu:
- Chọn lọc chủng đưa vào nghiên cứu: các chủng nghi nghờ K. pneumoniae
kháng carbapenem thu từ các bệnh viện được đưa về phòng thí nghiệm công ty Nam Khoa, đổi tên mã chủng ở bệnh viện thành mã ID từ 1 đến 21 được sử dụng trong suốt đề tài, giữ chủng trong glycerol 20%, bảo quản trong tủ đông sâu -70oC (Akira, Nhật).
- Định danh vi khuẩn: định danh sinh hóa các chủng mọc được trên môi trường
MC bằng bộ hóa chất IDS14 ®GNR , các chủng khác K. pneumoniae được định danh
lại bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA.
- Thực hiện kháng sinh đồ: kết quả kháng sinh đồ giúp xác định các vi khuẩn có
khả năng tiết ESBL và kháng carbapenem (imipenem, meropenem). Các đĩa kháng sinh được đặt như trong hình 2.3 với nồng độ kháng sinh trong bảng 2.6.
- Xác định MIC: sử dụng phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng. Thí
nghiệm này hỗ trợ xác định các chủng kháng carbapenem đã xác định trong quá trình làm kháng sinh đồ.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
- Thử nghiệm Hodge: thực hiện cùng với chủng chuẩn theo qui trình của CLSI
2011.
- Khuyếch đại gen blaKPC: kiểm tra chương trình luân nhiệt tối ưu để khuếch
đại gen blaKPC.
- Giải trình tự gen blaKPC: nhằm khẳng định sản phẩm PCR thu được là sản
phẩm của gen blaKPC và xác định kiểu gen blaKPC.
Hình 2.3 Sơ đồ đặt các đĩa kháng sinh. Bảng 2.6 Tên và nồng độ kháng sinh trong kháng sinh đồ.
Kí hiệu Tên, nồng độ kháng sinh Kí hiệu Tên, nồng độ kháng sinh Ac Amoxiline/Clavulanate (20/10 µg) Cm Cefepime (30 µg)
Zc Ceftazidime/clavulanate (30/10 µg) Im Imipenem (30 µg) Cz Ceftazidime (30 µg) Me Meropenem (30 µg)
KẾT QUẢ BIỆN LUẬN 3. Kết quả và biện luận
3.1 Kết quảđịnh danh vi khuẩn
3.1.1 Kết quảđịnh danh sinh hóa
Môi trường MC có crystal violet và muối mật có tác dụng ức chế vi khuẩn Gram dương. Chất chỉ thị neutral red trong môi trường giúp phân biệt các chủng lên men lactose có khuẩn lạc màu hồng với các chủng khuẩn lạc màu trắng không lên men lactose. Sau khi phân lập trên môi trường này, 21 chủng thí nghiệm đều mọc được chứng tỏ đây đều là các vi khuẩn Gram âm. Các khuẩn lạc đều tròn, nhầy, bóng, có màu hồng, riêng chủng 09, 10, 13 có khuẩn lạc màu hồng nhạt. Tất cả các chủng đều được xác định là trực khuẩn Gram âm nhờ kĩ thuật nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi điện tử với vật kính dầu X100.
A B
C D
Hình 3.1 Kết quả nuôi cấy và quan sát trên kính hiển vi điện tử.
Ghi chú: Khuẩn lạc chủng 01 (A) và 09 (C) trên môi trường MC; Hình ảnh
KẾT QUẢ BIỆN LUẬN Bảng 3.1 Kết quả định danh bằng bộ hóa chất IDS14 GNR®
ID KIA (G/L/H2S/GAS ) OX I GL U NI T ONP G UR E PA D CI T ES C H2 S IN D V P ML O LD C MOB Mã IDS14 Kết quả 01 +/+/-/+ - + + + - - + + - - + + + - 61361 KL P 02 +/+/-/- - + + + - - + + - - + + + - 61361 KL P 03 +/+/-/- - + + + - - + + - - + + + - 61361 KL