Các chủng vi khuẩn thí nghiệm được phân lập trên môi trường MacConkey agar (MC). Các vi khuẩn mọc được được định danh bằng bộ hóa chất định danh IDS 14® GNR (Nam Khoa, Việt Nam) dùng cho định danh các trực khuẩn Gram âm dễ mọc.
2.2.2.1 Nguyên tắc một số phản ứng sinh hóa định danh nhóm trực khuẩn Gram âm
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Thử nghiệm khả năng lên men
Khi sử dụng các nguồn cacbon để lên men, tùy phương thức lên men các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2,… Trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
Nhằm xác định vi sinh vật có có hệ enzyme citratase có khả năng khử nitrat thành nitrite hay nitơ tự do trong điều kiện kị khí. Nitrite được tạo ra sẽ phản ứng với sulphanilamide và N-napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng.
Thử nghiệm ONPG
Các vi khuẩn có khả năng len men đường lactose nhanh có khả năng sản xuất cả 2 loại men lactose permease và β-galactosidase. Một số vi khuẩn được xem là nhóm vi khuẩn lên men lactose chậm chỉ sản xuất được β-galactosidase. Hoạt tính của enzyme này có thể xác định dựa một cơ chất tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG). Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi β-galactosidase sẽ phóng thích o- nitrophenol có màu vàng.
Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
Thử nghiệm Urease
Vi khuẩn tiết men urease có khả năng thủy phân urê trong môi trường thành CO2 và NH3 làm môi trường bị kiềm hóa. Chất chỉ thỉ Phenol Red trong môi trường thử nghiệm làm môi trường chuyển sang màu đỏ.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Phenylalanine deaminase (PAD)
Một số vi khuẩn thuộc bộ lạc Proteeae như Proteus, Morganella, Providencia có khả năng sản xuất men deaminase khử amin của amino acid phenylalanine thành một keto acid, chất này kết hợp với ion sắt trong thuốc thử Ferric chloride 10% để cho ra màu xanh lá cây.
Thử nghiệm bile esculine
Thử nghiệm này giúp phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong esculine thành esculetin và glucose tự do khi có sự hiện diện của muối mật. Esculetin tạo ra sẽ phản ứng với muối sắt trong môi trường thử nghiệm tạo thành hợp chất màu đen hay nâu đen.
Thử nghiệm khả năng sinh indol
Thử nghiệm này phát hiên vi sinh vật sản xuất men tryptophanase khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường canh trypton. Phản ứng thủy phân trytophan tạo thành Indole, chất này kết hợp với Para-dimethylamino benzaldehyde trong thuốc thử Kovác cho ra một hợp chất muối dimethyl ammonium màu đỏ.
Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Chất này bị oxid hóa trong môi trường kiềm biến đổi thành diacetyl, dưới sự xúc tác của alpha-naphthol để cho một phức chất màu hồng đỏ.
Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate
Thử nghiệm nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng malonate như là nguồn carbon duy nhất trong môi trường. Các vi sinh vật biến dưỡng malonate sẽ sử dụng chu trình glyoxylic acid để biến dưỡng năng lượng. Nếu không sử dụng được malonate, chất này có tác dụng như một chất diệt khuẩn. Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng malonate đồng thời có khả năng sử dụng ammonium là nguồn đạm duy nhất. Do vậy khả năng biến dưỡng malonate được ghi nhận nhờ sự phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi trường và chuyển màu của chỉ thị pH.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Thử nghiệm KIA
Thử nghiệm này nhằm phát hiện khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate, khả năng sinh H2S và sinh khí trong môi trường KIA chứa hai loại đường lactose 1% và glucose 0.1%. Sau khi nuôi cấy chủng này 18-24 giờ, có ba trường hợp có thể xảy ra:
+ Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, phần trên bề mặt của ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid. Điều này có thể giải thích do vi sinh vật sau khi sử dụng hoàn toàn lượng glucose ít ỏi trên bề mặt mội trường, chúng tiếp tục dị hóa pepton trong môi trường giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm. Ở phần sâu trong môi trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose được lên men kỵ khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường. Nếu trong môi trường có chất chỉ thị phenol red thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu sẽ có màu vàng.
+ Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, toàn bộ môi trường trở nên có pH acid, vi sinh vật không cần phải sử dụng đến pepton để tạo năng lượng.
+ Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton được sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, do pepton chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa chỉ diễn ra trên phần của bề mặt môi trường và chỉ phần này mới trở nên có màu đỏ. Trong khi đó, phần môi trường sâu trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng đổi màu.
Trong các trường hợp nêu trên, sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí được nhận biết nhờ các khí này đẩy ống thạch lên trên hay làm vỡ thạch. Thử nghiệm này cũng có thể phát hiện khả năng sinh H2S do thành phần môi trường có chứa sodium thiosulphate. Vi sinh vật khử sulfate có thể khử hợp chất này để giải phóng H2S. Khí H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thị ammonium citrate hiện diện trong môi trường.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiêm mao phân bố tại các vi trí khác nhau trên tế bào vi sinh vật. Trong môi trường thử nghiệm tính di động thường bổ sung triphenyltetrazolium chloride để phát hiện dễ dàng vị trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ.
Thử nghiệm decarboxylase
Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme carboxylase thủy phân được các axít amin đặc hiệu để xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl. Các enzyme carboxylase chỉ được cảm ứng tổng hợp khi môi trường có tính acid và chứa chất cảm ứng đặc hiệu. Phản ứng tạo CO2 trong điều kiện kỵ khí, CO2 sinh ra làm giảm pH của môi trường và được ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH.
2.2.2.2 Cách tiến hành:
Tiến hành các phản ứng sinh hóa trong hệ thống định danh IDS14 GNR® (Nam Khoa, Việt Nam). Bộ hóa chất bao gồm:
Đĩa giấy oxidase (OXI): thực hiện thử nghiệm oxidase - Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame.
- Dùng kẹp giấy lấy một đĩa giấy oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý cho vừa đủ ướt và đặt lên lame.
- Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giấy oxidase.
- Đọc kết quả sau 10 giây: phản ứng dương tính khi đĩa giấy oxidase xuất hiện màu tím đen; âm tính khi đĩa giấy oxidase không có màu tím đen.
Bảng nhựa có 10 giếng chứa 10 loại đĩa giấy sinh hóa
- Dùng tăm bông vô trùng lấy khúm khuẩn cho vào nước muối sinh lý vô trùng để làm thành huyền dịch có độ đục McFarland 2,0.
- Cho vào mỗi giếng 200 µl huyền dịch, đậy nắp. - Ủ 35-37oC/12-24 giờ.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP - Đọc kết quả theo bảng 2.1.
Môi trường Lysin decarboxylase (LDC) thực hiện thử nghiệm Lysin decarboxylase
- Dùng pipet pasteur hay micropiper lấy 2-3 giọt huyền phù cho vào môi trường LDC, xuyên pha lớp parafilm.
- Ủ 35-37oC/12-24 giờ.
- Đọc kết quả: dương tính khi môi trường có vi khuẩn mọc và có màu tím ;
âm tính khi môi trường có màu vàng hoặc có vàng tím.
Môi trường mobility (MOB) thực hiện thử nghiệm di động
- Dùng que cấy vô trùng lấy khúm khuẩn và cắm kim cấy cách 2/3 đáy ampule chứa môi trường MOB, rút que cấy theo chiều thẳng đứng, cấy ria trên bề mặt thạch.
- Ủ 35-37oC/12-24 giờ
- Đọc kết quả: vi khuẩn có khả năng di động khi màu đỏ lan rộng ra khỏi
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Bảng 2.1 Hướng dẫn đọc kết quả các phản ứng sinh hóa trong bộ IDS14 GNR®
Kết quả thử nghiệm Giếng số Ký hiệu Thử nghiệm sinh hóa Thuốc thử thêm vào (+) (-)
1 GLU Lên men
Glucose Vàng Tím 2 NIT Khử Nitrate thành Nitrite Tìm Nitrite Đỏ/hồng (xuất hiện trong vòng 3 phút) Vàng nhạt
3 ONPG Thủy giải
ONPG Vàng nhạt
4 URE Sinh Urease Đỏ cánh sen Vàng/đỏ
nhạt 5 PAD Phenyl Alanine Deaminase FeCl3
Xanh lá (xuất hiện ngay khi bỏ thuốc thử,
để lâu sẽ mất màu) Vàng nhạt 6 CIT Sử dụng Citrate Xanh biển (chỉ cần có ánh xanh biển) Xanh lá/vàng
7 ESC Thủy giải Esculine
Đen (có màu từ đen nhạt qua đen đậm
Không đen
H2S Sinh H2S
Đen (xuất hiện đáy giếng, mất màu khi nhỏ Kovac vào)
Không đen 8
IND Sinh indol Kovac
Đỏ bề mặt (đọc sau 1 phút, không đọc sau 10 phút) Vàng bề mặt 9 VP Voges- Proskauer KOH + Napthtol
Đỏ (xuất hiện sau 5 phút, không đọc kết
quả sau 2h)
Vàng nhạt
10 MLO Sử dụng
malonate Xanh biển
Xanh lá/vàng Đọc kết quả định danh: Hệ thống định danh phân chia các thử nghiệm sinh hóa theo nhóm như trong hình 2.1.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Hình 2.1 Hướng dẫn định danh vi khuẩn Gram âm dễ mọc nhờ bộ hóa chất
IDS14 GNR®
Sau khi có kết quả các phản ứng sinh hóa (theo hướng dẫn ở bảng 2.1) cùng số điểm tương ứng với từng nhóm (hình 2.1), ta có được mã định danh. Từ đó ta có thể tra cứu hệ thống mã định danh của IDS14 GNR ®để xác định vi khuẩn cần định danh.
2.2.3 Phương pháp giải trình tự gen 16S RNA
Nguyên tắc: gen 16S rRNA có chiều dài khoảng 1542 bp với nhiều trình tự bảo
tồn, trong đó có một đoạn trình tự chiều dài khoảng 550 bp đặc hiệu cho giống và loài của vi khuẩn. Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh chính xác loài vi khuẩn.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.2.3.1 Tách chiết DNA vi khuẩn
Phương pháp: DNA của vi khuẩn được tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt
với qui trình như sau:
- Lấy một khúm khuẩn cho vào tube eppendorf có chứa sẵn 200 µl dung dịch TE, trộn đều để tạo huyền dịch vi khuẩn
- Đun sôi mẫu ở 100oC trong 10 phút sau đó chuyển ngay sang khay đá trong 5 phút.
- Ly tâm 14000 RPM trong 10 phút.
- Hút dịch nổi chứa DNA vi khuẩn sang eppendorf mới. 2.2.3.2 Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rRNA
Phương pháp: sử dụng bộ hóa chất NK16S-PCR của công ty Nam Khoa với các thành phần như trong bảng 2.2.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA.
Tên hóa chất Nồng độ trong 1 thể tích phản ứng PCR (50 µl) PCR buffer 1 X MgCl2 1,5 mM Tag polymerase 1,25 U dNTP 200 µM mỗi loại Mồi xuôi NK16s-F 20 pm Mồi ngược NK16s- R 20 pm dUTP 200 µM UNG 1 U
H2O Thêm vào cho đủ 45 µl
Mẫu 5 µl
Chương trình luân nhiệt của phản ứng PCR 16S rRNA 1 chu kỳ 40oC trong 10 phút
1 chu kỳ 95oC trong 10 phút 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây 60oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút 3 chu kỳ 72oC trong 10 phút 2.2.3.3 Tinh sạch sản phẩm PCR
Mục đích: loại bỏ mồi còn dư, dNTP cùng các thành phần khác, đảm bảo độ
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp: sử dụng bộ hóa chất QIAquick PCR Purification Kits
(QUIAGEN, Mỹ). Bộ kit này được chế tạo dựa trên khả năng bám của DNA lên silica khi có mặt của nồng độ muối cao và pH thích hợp (pH ≤ 7). Các chất không mong muốn như mồi dư, muối, enzyme, những nucleotit không bắt cặp,… không bám vào màng silica mà đi qua cột nhờ ly tâm. Muối được rửa khỏi cột bằng dung dịch đệm chứa ethanol. Dung dịch đệm rửa còn lại trong cột có thể ảnh hưởng đến các phản ứng enzyme sau này bị loại ra khỏi cột nhờ ly tâm. Dung dịch ly giải EB có nồng độ muối thấp và pH cao (pH 8,5) giúp DNA được ly giải ra khỏi cột. Cuối cùng là quá trình ly tâm để thu được dịch chứa DNA tinh sạch.
Cách sử dụng bộ hóa chất QIAquick PCR Purification Kits Vật liệu - Hóa chất
- QUIAquick Spin columns.
- Buffer PB (guanidine hydrochloride, isopropanol).
- Buffer PE (bổ sung ethanol 100%).
- Buffer EB (10 nM TrisCl, pH 8,5).
- pH indicator.
- Sodium acetate 3 M , pH 5.
- Collection Tube.
Qui trình:
- Hòa dung dịch PB vào tube chứa sản phẩm khuếch đại DNA theo tỉ lệ 1:5
- Chuyển dung dịch này qua hệ thống QUIAquick Spin columns đã đặt vào một collection tube, ủ 1,5 phút ở nhiệt độ phòng để DNA bám lên màng, sau đó ly tâm 16000 RPM trong 1 phút .
- Loại bỏ dịch trong collection tube, rửa cột bằng 700 µl dung dịch PE (đã pha loãng với ethanol 95%), ly tâm 16000 RPM trong 1,5 phút.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP - Đặt QUIAquick Spin columns vào tube mới, cho vào 20-35 µl EB, để yên ở
nhiệt độ phòng trong 1-2 phút, sau đó ly tâm 16000 RPM trong 1 phút. Dịch thu được chứa DNA tinh sạch.
2.2.3.4 Xác định nồng độ DNA sau tinh sạch
Mục đích: kiểm tra nồng độ DNA tinh sạch nhằm bổ sung thể tích thích hợp vào
phản ứng PCR giải trình tự để thu được hiệu quả khuyếch đại tốt nhất.
Phương pháp: Dùng máy phân tích tự động Aligent 2100 Bioanalyser (Agilent
Technologies, Mỹ) xác định nhanh chóng nồng độ tương đối của DNA sau khi tinh sạch nhằm xác định được thể tích cẩn bổ sung vào phản ứng PCR giải trình tự.
Qui trình:
- Cho 9 µl Gel-dye vào giếng G, dùng piston ép gel trong 1 phút để gel theo ống mao quản đi vào các giếng khác.
- Bổ sung 5 µl maker vào mỗi giếng
- Cho 1 µl ladder vào giếng L và 1 µl mẫu vào cẩn kiềm tra vào giếng còn lại. - Vortex hỗn hợp trong vòng 1 phút, đặt vào máy Agilent 2100 Bioanalyser. 2.2.3.5 PCR giải trình tự
Các mẫu DNA tinh sạch cho kết quả điện di tốt được đưa vào chu trình nhiệt của phản ứng PCR giải trình tự nhằm tạo đoạn DNA có gắn các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang. Phản ứng PCR giải trình tự được thực hiện trong 2 phản ứng với lần lượt 2 cặp mồi NK16s-F và NK16s- R nhằm thu được đoạn trình tự có độ dài mong muốn.
Thành phần phản ứng PCR giải trình tự
Big dye Terminator 1 µl Big Dye buffer 3,5 µl Mồi (5 pmol/µl) 0,7 µl
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Nước khử ion thêm vào cho đủ 20 µl
Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR giải trình tự
1 chu kỳ 96oC trong 1 phút 25 chu kỳ 96oC trong 10 giây
50oC trong 5 giây 60oC trong 4 phút 1 chu kỳ 4oC trong 10 phút
2.2.3.6 Tủa và tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự