Nguyên tắc: gen 16S rRNA có chiều dài khoảng 1542 bp với nhiều trình tự bảo
tồn, trong đó có một đoạn trình tự chiều dài khoảng 550 bp đặc hiệu cho giống và loài của vi khuẩn. Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh chính xác loài vi khuẩn.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.2.3.1 Tách chiết DNA vi khuẩn
Phương pháp: DNA của vi khuẩn được tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt
với qui trình như sau:
- Lấy một khúm khuẩn cho vào tube eppendorf có chứa sẵn 200 µl dung dịch TE, trộn đều để tạo huyền dịch vi khuẩn
- Đun sôi mẫu ở 100oC trong 10 phút sau đó chuyển ngay sang khay đá trong 5 phút.
- Ly tâm 14000 RPM trong 10 phút.
- Hút dịch nổi chứa DNA vi khuẩn sang eppendorf mới. 2.2.3.2 Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rRNA
Phương pháp: sử dụng bộ hóa chất NK16S-PCR của công ty Nam Khoa với các thành phần như trong bảng 2.2.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA.
Tên hóa chất Nồng độ trong 1 thể tích phản ứng PCR (50 µl) PCR buffer 1 X MgCl2 1,5 mM Tag polymerase 1,25 U dNTP 200 µM mỗi loại Mồi xuôi NK16s-F 20 pm Mồi ngược NK16s- R 20 pm dUTP 200 µM UNG 1 U
H2O Thêm vào cho đủ 45 µl
Mẫu 5 µl
Chương trình luân nhiệt của phản ứng PCR 16S rRNA 1 chu kỳ 40oC trong 10 phút
1 chu kỳ 95oC trong 10 phút 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây 60oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút 3 chu kỳ 72oC trong 10 phút 2.2.3.3 Tinh sạch sản phẩm PCR
Mục đích: loại bỏ mồi còn dư, dNTP cùng các thành phần khác, đảm bảo độ
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp: sử dụng bộ hóa chất QIAquick PCR Purification Kits
(QUIAGEN, Mỹ). Bộ kit này được chế tạo dựa trên khả năng bám của DNA lên silica khi có mặt của nồng độ muối cao và pH thích hợp (pH ≤ 7). Các chất không mong muốn như mồi dư, muối, enzyme, những nucleotit không bắt cặp,… không bám vào màng silica mà đi qua cột nhờ ly tâm. Muối được rửa khỏi cột bằng dung dịch đệm chứa ethanol. Dung dịch đệm rửa còn lại trong cột có thể ảnh hưởng đến các phản ứng enzyme sau này bị loại ra khỏi cột nhờ ly tâm. Dung dịch ly giải EB có nồng độ muối thấp và pH cao (pH 8,5) giúp DNA được ly giải ra khỏi cột. Cuối cùng là quá trình ly tâm để thu được dịch chứa DNA tinh sạch.
Cách sử dụng bộ hóa chất QIAquick PCR Purification Kits Vật liệu - Hóa chất
- QUIAquick Spin columns.
- Buffer PB (guanidine hydrochloride, isopropanol).
- Buffer PE (bổ sung ethanol 100%).
- Buffer EB (10 nM TrisCl, pH 8,5).
- pH indicator.
- Sodium acetate 3 M , pH 5.
- Collection Tube.
Qui trình:
- Hòa dung dịch PB vào tube chứa sản phẩm khuếch đại DNA theo tỉ lệ 1:5
- Chuyển dung dịch này qua hệ thống QUIAquick Spin columns đã đặt vào một collection tube, ủ 1,5 phút ở nhiệt độ phòng để DNA bám lên màng, sau đó ly tâm 16000 RPM trong 1 phút .
- Loại bỏ dịch trong collection tube, rửa cột bằng 700 µl dung dịch PE (đã pha loãng với ethanol 95%), ly tâm 16000 RPM trong 1,5 phút.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP - Đặt QUIAquick Spin columns vào tube mới, cho vào 20-35 µl EB, để yên ở
nhiệt độ phòng trong 1-2 phút, sau đó ly tâm 16000 RPM trong 1 phút. Dịch thu được chứa DNA tinh sạch.
2.2.3.4 Xác định nồng độ DNA sau tinh sạch
Mục đích: kiểm tra nồng độ DNA tinh sạch nhằm bổ sung thể tích thích hợp vào
phản ứng PCR giải trình tự để thu được hiệu quả khuyếch đại tốt nhất.
Phương pháp: Dùng máy phân tích tự động Aligent 2100 Bioanalyser (Agilent
Technologies, Mỹ) xác định nhanh chóng nồng độ tương đối của DNA sau khi tinh sạch nhằm xác định được thể tích cẩn bổ sung vào phản ứng PCR giải trình tự.
Qui trình:
- Cho 9 µl Gel-dye vào giếng G, dùng piston ép gel trong 1 phút để gel theo ống mao quản đi vào các giếng khác.
- Bổ sung 5 µl maker vào mỗi giếng
- Cho 1 µl ladder vào giếng L và 1 µl mẫu vào cẩn kiềm tra vào giếng còn lại. - Vortex hỗn hợp trong vòng 1 phút, đặt vào máy Agilent 2100 Bioanalyser. 2.2.3.5 PCR giải trình tự
Các mẫu DNA tinh sạch cho kết quả điện di tốt được đưa vào chu trình nhiệt của phản ứng PCR giải trình tự nhằm tạo đoạn DNA có gắn các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang. Phản ứng PCR giải trình tự được thực hiện trong 2 phản ứng với lần lượt 2 cặp mồi NK16s-F và NK16s- R nhằm thu được đoạn trình tự có độ dài mong muốn.
Thành phần phản ứng PCR giải trình tự
Big dye Terminator 1 µl Big Dye buffer 3,5 µl Mồi (5 pmol/µl) 0,7 µl
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Nước khử ion thêm vào cho đủ 20 µl
Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR giải trình tự
1 chu kỳ 96oC trong 1 phút 25 chu kỳ 96oC trong 10 giây
50oC trong 5 giây 60oC trong 4 phút 1 chu kỳ 4oC trong 10 phút
2.2.3.6 Tủa và tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
Mục đích: loại bỏ các Bigdye terminators còn dư và các thành phần dư khác
trong buffer trước khi tiến hành điện di mao quản nhằm thu được tín hiệu tốt hơn trên máy giải trình tự tự động.
Phương pháp: sử dụng nồng độ muối cao trong ethanol tuyệt đối để tủa DNA. Qui trình
- Cho 2 µl EDTA 0,125 M; 2 µl sodium acetate 3 M, 50 µl ethanol 100% và 20 µl sản phẩm sau khi chạy PCR sequecing, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 17000 RPM trong 20 phút.
- Úp ngược để loại dịch nổi, ly tâm 200 RPM trong 1 phút. - Thêm 50 µl ethanol 75%, ly tâm 17000 RPM trong 20 phút. - Úp ngược để loại dịch nổi, ly tâm 200 RPM trong 1 phút.
- Đổ bỏ ethanol dư rồi sấy khô bằng bồn hút chân không trong 10 phút. - Cho 20 µl Hi-di, để 10 phút ở nhiệt độ phòng sau đó đặt vào hệ thống
máy giải trình tự tự động ABI 3130 XL Genetic Analyser. 2.2.3.7 Điện di mao quản DNA
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Nguyên tắc: đoạn DNA mạch đơn được đánh dấu bằng 4 màu huỳnh quang
khác nhau tại đầu 5’ di chuyển trên gel polyacriamide trong quá trình điện di. Các vạch điện di được các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hiệu được mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Tử biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự đoạn DNA [10].
Phương pháp: thực hiện điện đi trên máy giải trình tự ABI 3130 XL Genetic
Analyser (Applied Biosystem, Mỹ) với gel POP-7. 2.2.3.8 Xử lý kết quả giải trình tự
Kết quả được phân tích bằng phần mầm Sequencing analysis, được lưu dưới định dạng fasta và được xử lý bằng phần mềm Bioedit nhằm đưa ra chuỗi trình tự tốt nhất.
Chuỗi trình tự được so sánh với các trình tự tham khảo trên ngân hàng NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov) thông qua công cụ BLAST nhằm xác định chính xác tên vi
khuẩn.
2.2.4 Phương pháp phát hiện vi khuẩn có kiểu hình tiết ESBL 2.2.4.1 Phương pháp đĩa đôi 2.2.4.1 Phương pháp đĩa đôi
Nguyên tắc: dựa vào sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin ở vùng
giao tiếp với đĩa chứa clavulanate khi vi khuẩn có khả năng tiết ESBL.
Tiến hành: lấy vi khuẩn tươi trên hộp thạch MC (cấy không quá 24 giờ) pha
thành dịch huyền phù có McF 0,5 trong nước muối sinh lý. Sau đó dùng tăm bông vô trùng trải đều huyền địch trên môi trường kháng sinh đồ MHA, để khô. Sau đó đặt đĩa kháng sinh Amoxiline/clavulanate (Ac) ở trung tâm và ceftazidime (hoặc cefotaxime) cách Ac 15 mm. Ủ trong điều kiện thích hợp (37oC, 16-18 giờ).
Đọc kết quả: kiểu hình ESBL dương khi có sự xuất hiện hình “cổ chai” do sự
mở rộng vòng vô khuẩn từ đĩa ceftazidime (hoặc cefotaxime) ở vùng giao tiếp với đĩa Amoxiline/clavulanate.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Nguyên tắc: Dựa trên phát hiện tính hiệp lực của đĩa kháng sinh cephalosporin
và cephalosporin + chất ức chế β-lactamase khi thực hiện kháng sinh đồ. Các enzyme ESBL do vi khuẩn sản sinh bị ức chế bởi một số chất ức chế beta-lactamase như acid clavulanic nên môi trường chứa kháng sinh có bổ sung acid clavulanic sẽ ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn sản sinh ESBL mạnh hơn so với môi trường chỉ chứa kháng sinh.
Tiến hành: lấy vi khuẩn tươi trên hộp thạch MC (cấy không quá 24 giờ) pha
thành dịch huyền phù có McF 0,5 trong nước muối sinh lý. Sau đó dùng tăm bông vô trùng trải đều huyền địch trên môi trường kháng sinh đồ MHA, để khô. Sau đó đặt đĩa kháng sinh Ceftazidime và (ceftazidime + acid clavulanic) lên và ủ trong điều kiện thích hợp (37oC, 16-18 giờ).
Đọc kết quả: Sau 16-18 giờ ủ ở 37oC, đo đường kính vòng vô khuẩn. Thử nghiệm sàng lọc ESBL ban đầu dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, các chủng có đường kính vòng vô khuẩn đĩa Ceftazidime ≤ 22 mm có kết quả sàng lọc dương tính. Các chủng được xác định có kiểu hình tiết ESBL khi có kết quả quả sàng lọc dương tính đồng thời có vòng vô khuẩn của đĩa (ceftazidime + acid clavulanic) rộng hơn so với đĩa ceftazidime 5 mm [67, trang 48].
2.2.5 Phương pháp phát hiện vi khuẩn có khả năng sinh carbapenmase 2.2.5.1 Phương pháp khuyếch tán kháng sinh 2.2.5.1 Phương pháp khuyếch tán kháng sinh
Nguyên tắc: khi đặt đĩa kháng sinh trên môi trường đã trải vi khuẩn, kháng sinh
từ đĩa khuếch tán ra môi trường và ức chế sự phát triển của vi khuẩn tạo thảnh vòng vô khuẩn. Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn xung quanh đĩa kháng sinh để biện luận vi khuẩn đề kháng, trung gian hay nhạy cảm theo tiêu chuẩn
Phương pháp: lấy vi khuẩn tươi trên hộp thạch MC (cấy không quá 24 giờ) pha
thành dịch huyền phù có McF 0.5 trong nước muối sinh lý. Sau đó dùng tăm bông vô trùng trải đều huyền địch trên môi trường kháng sinh đồ MHA, để khô. Sau đó đặt đĩa
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP kháng sinh imipenem, meropenem, lên và ủ trong điểu kiện thích hợp (37oC, 16-18 giờ).
Đọc kết quả: đo đường kính vòng vô khuẩn, biện luận theo tiêu chuẩn của CLSI
2011 (Bảng 2.3).
Bảng 2.3 Hướng dẫn biện luận tính kháng của nhóm Enterobacteriacea theo CLSI 2011 [67, trang 45]
Biện luận Tiêu chuẩn
biện luận Kháng sinh
Kháng (R) Trung gian (I) Nhạy (S)
Imipenem (10 µg) ≤ 19 mm 20-22 mm ≥ 23 mm Đường kính vòng vô khuẩn Meropenem (10 µg) ≤ 19 mm 20-22 mm ≥ 23 mm Meropenem ≤ 1 µg/ml 2 µg/ml ≥ 4 µg/ml Doripenem ≤ 1 µg/ml 2 µg/ml ≥ 4 µg/ml MIC Ertapenem ≤ 0,25 µg/ml 0,5 µg/ml ≥ 1 µg/ml
2.2.4.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Phương pháp: vi pha loãng trong môi trường lỏng Cách tiến hành
- Cho 200 µl môi trường lỏng Muller Hinton (MH) vào lọ kháng sinh đông khô (nồng độ 256 µg/ml) và 90 µl MH vào mỗi giếng trong bảng nhựa 12 giếng.
- Cho 90 µl dung dịch kháng sinh vào giếng số 1, trộn đều và pha loãng ½ sang giếng số 2. Thực hiện tương tự cho đến giếng số 11. Giếng số 12 không có kháng sinh nhằm kiểm soát quá trình pha loãng vi khuẩn và bổ sung vi khuẩn.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
- Cho 10 µl dịch huyền phù vi khuẩn đã pha loãng 1/100 vào từng giếng. Riêng giếng số 11 không bổ sung vi khuẩn nhằm kiểm soát quá trình ngoại nhiễm.
- Ủ 37oC/16-20 giờ.
Đọc kết quả: MIC (µg/ml) là giá trị tương ứng với nồng độ kháng sinh trong
giếng mà vi khuẩn bắt đầu không mọc, trong đó giá trị nồng độ kháng sinh trong các giếng như sau:
Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Nồng độ
(µg/ml)
128 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0
Dự vào kết quả MIC vi khuẩn được xác định là kháng, nhạy hay trung gian với carbapenem theo tiêu chuẩn của CLSI 2011 (Bảng 2.2).
2.2.5.3 Thử nghiệm Hodge cải biên
Mục đích: nhằm khẳng định kiểu hình tiết carbapenemase. Đây là thử nghiệm
được đánh giá có độ nhạy rất cao (100%).
Cách tiến hành
- Trải chủng E.coli ATCC ® 25922 nhạy cảm meropenem lên môi trường
kháng sinh đồ MHA.
- Đặt đĩa kháng sinh meropenem lên giữa đĩa thạch.
- Cấy chủng cần kiềm đồng thời với chủng chứng âm K. pneumoniae ATCC ® 1706 và chủng chứng dương K. pneumoniae ATCC ®1705. Đường cấy thẳng
từ đĩa meropenem ra ngoài chu vi đĩa thạch.
- Ủ 37oC/18-24 giờ.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Chủng có tiết carbapenemase có khả năng tăng cường sự tăng trưởng của E.coli
ATCC ® 25922 nên vòng vô khuẩn có hình “cỏ ba lá”. Đối với chủng không tiết carbapenemase thì vòng vô khuẩn có hình tròn (hình 2.2).
Hình 2.2 Thử nghiệm Hodge cải biên trên môi trường MHA [67, trang 52]
Ghi chú: (1) K. pneumoniae ATCC ® 1705.
(2) K. pneumoniae ATCC ® 1706.
(3) Chủng thí nghiệm có MHT dương tính.
2.2.6 Phương pháp xác định vi khuẩn mang gen blaKPC 2.2.6.1 Phương pháp PCR
Dịch ly trích vi khuẩn được bổ sung vào phản ứng PCR khuyếch đại gen blaKPC với các thành phần cho một phản ứng thể tích 50 µl như sau:
PCR buffer 1 X MgCl2 2 mM Tag polymerase 1,25 U dNTP 200 µM mỗi loại Mồi xuôi F 25 pm Mồi ngược R 25 pm
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Mẫu 5 µl
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 2 cặp mồi đều khuyếch đại được đoạn gen blaKPC nhưng với kích thước khác nhau nhằm thu được kết quả tin cậy hơn: cặp mồi blaKPC-F và blaKPC-R khuếch đại đoạn gen blaKPC với độ dài khoảng 400 bp, cặp mồi blaKPCu-F và blaKPCu-R cũng khuếch đại đoạn gen blaKPC nhưng với độ dài lớn hơn (khoảng 533 bp). Trình tự cặp mồi sử dụng được mô tả trong bảng 2.4. Kết quả dương tính khi có cả 2 sản phẩm khuyếch đại ở 2 phản ứng.
Bảng 2.4 Trình tự mồi sử dụng khuyếch đại gen blaKPC
Tên mồi Trình tự Tham khảo
blaKPC-F 5’-TCTGGACCGCTGGGAGCTGG-3’ [22] blaKPC-R 5’-TGCCCGTTGACGCCCAATCC-3’ [22] blaKPCu-F 5’- CAGCTCATTCAAGGGCTTTC-3’ [29] blaKPCu-R 5’- AGTCATTTGCCGTGCCATAC-3’ [29]
Để xác định chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành thử nghiệm hai chương trình luân nhiệt Tm55 và Tm60 với các thông số như trong bảng 2.5.
Bảng 2.5 Chương trình luân nhiệt Tm55 và Tm60
Tm55 Tm60
1 chu kỳ 95oC trong 5 phút 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây
55oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút 3 chu kỳ 72oC trong 10 phút
1 chu kỳ 95oC trong 5 phút 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây
60oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút 3 chu kỳ 72oC trong 10 phút
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
Qui trình được thực hiện trên chủng chứng dương K.pneumoniae ATCC ®1705 và chứng âm K.pneumoniae ATCC ® 1706 để kiểm tra điều kiện phản ứng trước khi
áp dụng cho 21 chủng thí nghiệm.
2.2.6.2 Điện di gel agarose
Mục đích: kiểm tra sự có mặt của sản phẩm khuyếch đại của phản ứng PCR. Nguyên tắc: DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường
của bản điện di tùy theo kích thước, những phân tử có kích thước nhỏ sẽ chạy nhanh hơn và xa hơn. Ethidium bromide bổ sung vào gel có khả năng chèn vào các sợi đôi DNA nên có thể phát hiện vạch DNA khuếch đại trên bản điện di dưới ánh sáng UV ở bước sóng 312 nm.
Phương pháp: hỗn hợp 8 µl sản phẩm khuyếch đại PCR và 5 µl dung dịch nạp
mẫu (Bromophenol Blue, Glycerol) nạp vào các giếng trong bảng gel agarose 2% (pha trong TBE 0,5 X) đã bổ sung ethidium bromide 4%, chạy trong thời gian 22 phút, 135 V trong dung dịch đệm TBE 0,5 X.
VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.2.6.3 Phương pháp giải trình tự gen
Qui trình giải trình tự đoạn gen blaKPC bao gồm các bước
Các phương pháp thực hiện tương tự phương pháp giải trình tự vi khuẩn
- Tinh sạch sản phẩm PCR: sử dụng bộ hóa chất QIAquick PCR Purification