2. Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tà
3.2.2.Phân tích đoạn gen H-FABP bằng enzyme cắt giới hạn Hae
Gen H-FABP đã được đọc trình tự và xác định đa hình độ dài đoạn giới hạn HaeIII, HinfI, MspI bởi Gerbens và cs, (1997) [19]. Cả 3 vị trí RFLP của gen H-FABP đã được xác định là đa hình ở hầu hết các giống lợn được nghiên cứu bởi Gerbens và cs, (1998) [20]. Và ở các giống lợn Trung Quốc như: Nanchang white, Erhualian, Yushan black pig, Leping, Jinhua và Shanggao
M 1 2 3 4 5
1kb
bởi Lin W.H và cs, (2002) [32]. Neijiang, Rongchang, Bamei, Hanjiang Black, Hanzhong White của Pang W.J và cs, (2006) [41].
Bảng tần số các alen ở cả 3 vị trí RFLP của gen H-FABP của một số giống lợn của Gerbens và cs, (1998) [20].
Bảng 3.1. Tần số các alen ở cả 3 vị trí RFLP của gen H-FABP của một số giống lợn RFLP Tần số alen alen DL DU GY HS ME PI WP MspI A 0,98 0,4 0,81 1,0 1,0 0,9 0,7 a 0,02 0,6 0,19 0 0 0,1 0,3 HaeIII D 0,32 0,4 0,31 1,0 1,0 0,5 0,1 d 0,68 0,6 0,69 0 0 0,5 0,9 HinfI H 0,7 0,7 0,97 0,67 0,45 0,7 0,9 h 0,3 0,3 0,03 0,33 0,55 0,3 0,1
Ductch Landrace (DL), Duroc (DU), Great Yorshire (GY), Hampshire (HS), Meishan (ME), Pietrain (PI), Wild pig (WP)
Ở Việt Nam Nguyễn Thu Thúy (2005) [8] đã đọc trình tự đoạn gen H- FABP của một số giống lợn ở Việt Nam và đã tìm ra đoạn gen H-FABP được nghiên cứu chứa 3 điểm cắt giới hạn của enzyme HaeIII (Trình tự nhận biết là GG CC) tại vị trí 1517, 1533 và 1811. Trong đó, có một điểm đột biến đa hình tại vị trí 1811, ở đó base guanine (G) bị thay thế bằng base cytosine (C). Khi HaeIII cắt đoạn gen H-FABP tại 3 vị trí trên sẽ tạo ra các đoạn DNA có kích thước 16 bp, 117 bp, 278 bp, 405 bp, tương ứng với kiểu alen d. Khi xảy ra đột biến thay thế base G bằng base C tại vị trí 1811 sẽ làm thay đổi trình tự nhận biết của enzyme HaeIII nên đoạn gen H-FABP chỉ bị cắt tại vị trí 1517 và 1533. Do đó, sản phẩm cắt đoạn gen H-FABP sẽ gồm các DNA có kích
Bảng 3.2. Các điểm cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H-FABP
Allele Vị trí Base Độ dài đoạn cắt (bp)
D 1517, 1533 G, G 683/117/16
d 1517, 1533, 1811 G, G, G 405/278/117/16
Sơ đồ vị trí cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H-FABP
117 bp HaeIII 16 bp HaeIII 683 bp Alen D GG CC GG CC
117 bp HaeIII 16 bp HaeIII 287 bp HaeIII 405 bp Alen d GG CC GG CC GGCC
Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR nhân đoạn gen H-FABP nhờ cặp mồi được thiết kế đặc hiệu, khuôn DNA, các chất cần thiết và các bước miêu tả chi tiết như phần phương pháp nghiên cứu, sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme HaeIII. Kết quả phân tích đa hình RFLP gen H-FABP với enzyme
HaeIII thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen H-FABP bằng enzyme
HaeIII 500bp 683bp 405bp 287bp 117bp 60bp 5 4 3 2 1 M 816bp
M: chỉ thị DNA 100 bp, 1- sản phẩm PCR; 2-5 sản phẩm cắt đoạn gen H- FABP. Trong đó giếng 2- kiểu gen dd; giếng 3, 4- kiểu gen Dd; giếng 5- kiểu gen DD.
Quan sát trên điện di đồ thể hiện ở hình 3.4 thấy rằng, sản phẩm cắt của đoạn gen H-FABP bởi enzyme HaeIII gồm các đoạn DNA có kích thước khác nhau, phù hợp với tính toán lý thuyết: Kênh 1 chỉ xuất hiện một băng có kích thước 816 bp đó là sản phẩm PCR của gen H-FBBP; Kênh 2 có kiểu gen dd, do chỉ có 1 alen bị cắt bởi enzyme HaeIII thành 4 đoạn có kích thước: 405 bp, 287 bp, 117 bp và 16 bp. Kênh 3, 4- kiểu gen Dd, do cả 2 alen D và d đều bị cắt bởi enzyme hình thành các đoạn:
683 bp, 405 bp, 287 bp, 117 bp, 60 bp. Kênh 5 có kiểu gen DD, do bị cắt bởi enzyme hình thành các đoạn: 683 bp, 117 bp và 60 bp.
Bảng 3.3. Kết quả phân tích đa hình RFLP kiểu gen H-FABP bằng enzyme HaeIII. Giống Tổng số mẫu Tỷ lệ kiểu gen DD Dd dd
mẫu % mẫu % mẫu %
Móng cái 97 96 99 1 1 0 0
Yorshire 53 20 37,7 29 54,7 4 7,6
Kết quả phân tích cho thấy lợn Móng Cái chỉ có kiểu gen DD và Dd, trong đó DD (99%) cao hơn nhiều kiểu gen Dd (1%). Đa hình RFLP ở gen H- FABP ở lợn Yorshire cao hơn giống lợn nội với 3 kiểu gen: DD, Dd, dd tần suất tương ứng là: 37,7%, 54,7%,7,6%. Điều này chứng tỏ rằng, tỷ lệ xảy ra đột biến ở vị trí 1811 ở lợn Móng Cái thấp hơn ở lợn Yorshire.
đó, thấy lợn mang kiểu gen aa/dd/HH có hàm lượng mỡ trong mô cao nhất [8]. Theo nghiên cứu của Pang và cs (2006) [41] trên lợn Duroc, Large White, Landrace, Neijiang, Rongchang, Banmei pig, Hanjiang Black, Hanzhong White và một số giống lợn địa phương thì kiểu gen của H-FABP có tương quan với hàm lượng mỡ cơ (P<0.05). Hàm lượng mỡ cơ tương ứng với các kiểu gen DD<Dd<dd: 2,27%<2,49%<2,91%. Như vậy kết quả nghiên cứu trên đối tượng lợn Móng Cái và Yorshire của chúng tôi tương ứng với các nghiên cứu trước.
Đồ thị tần số kiểu gen H-FABP của lợn Móng Cái (MC) và Yorshire (Y) 0 20 40 60 80 100 120 DD Dd dd kiểu gen tỉ lệ p hầ n tr ăm MC Y
3.3. Phân tích gen Lpin1 bằng phƣơng pháp PCR- RFLP 3.3.1. Phân tích gen Lpin1 bằng phƣơng pháp PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để phân tích gen Lpin1 bằng PCR-RFLP ta tiến hành nhân đoạn gen
Lpin1 bằng phương pháp PCR sau đó cắt sản phẩm thu được bằng enzyme
MspI.
Sử dụng chu trình nhiệt và thành phần phản ứng PCR thích hợp như phần vật liệu và phương pháp, chúng tôi tiến hành nhân đoạn gen Lpin1. Theo trình tự Genbank EU 164847, đoạn gen được nhân lên có kích thước 316 bp được thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen Lpin1
M: Chỉ thị DNA 100 bp, 1-8: sản phẩm PCR nhân đoạn gen Lpin1
Kết quả hình 3.5 cho thấy, sản phẩm PCR là một băng tương đối rõ nét tương ứng với kích thước 316 bp và không xuất hiện băng phụ, phù hợp với tính toán lý thuyết. Như vậy với chu trình nhiệt và thành phần phản ứng thích hợp chúng tôi đã nhân thành công đoạn gen Lpin1. Sản phẩm PCR thu được có chất lượng tốt phục vụ cho việc phân tích đa hình gen Lpin1.
8 7 6 5 4 3 2 1 M
316bp
3.3.2. Phân tích gen Lpin1 bằng enzyme cắt giới hạn MspI
Đoạn gen Lpin1 được nhân lên bằng phương pháp PCR và được cắt với enzyme giới hạn MspI, sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose 2 % để kiểm tra kiểu gen.
Theo trình tự đoạn gen Lpin1 (Genbank EU164847) thì vị trí cắt, trình tự nhận biết của MspI, độ dài đoạn cắt và các dạng alen có thể xuất hiện được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Điểm cắt của MspI ở đoạn gen Lpin1
Alen Số điểm cắt Độ dài đoạn cắt (bp) Sản phẩm
cắt
T 0 316
C 1 256/60
Sơ đồ vị trí cắt của MspI trên đoạn gen Lpin1
316 bp Alen T CTGG
60 bp MspI 256 bp Alen C CCGG
Đoạn gen Lpin1 chứa trình tự nhận biết của enzyme MspI ở vị trí
(C CGG). Khi MspI cắt tại vị trí trên sẽ tạo ra hai đoạn DNA có kích thước phân tử tương ứng là 256 bp và 60 bp tạo thành alen C. Trường hợp trình tự base tại vị trí trên thay đổi (đột biến) thì đoạn DNA không bị cắt nên sản phẩm cắt là đoạn gen có kích thước 316 bp tạo thành alen T. Như vậy với 2 dạng alen T và C sẽ có 3 kiểu gen của Lpin1: TT, TC, CC.
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen Lpin1 được cắt bởi enzyme MspI. Kết quả điện di kiểm tra kiểu gen thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen Lpin1 bằng enzyme MspI
M: Chỉ thị DNA 100 bp, 1-8 sẳn phẩm cắt đoạn gen Lpin1. Trong đó: giếng 1, 2 kiểu gen TT; giếng 3, 5, 7, 8 kiểu gen TC; 4, 6 kiểu gen CC.
Các kiểu gen đã được phân tích thể hiện ở các đoạn DNA có kích thước khác nhau, các mẫu phân tích RFLP mang cả 2 dạng alen, tức là điểm cắt
MspI có tính đa hình. Kết quả điện di rõ ràng và có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết: Kênh 1, 2 có kiểu gen TT, do enzyme MspI không cắt alen nên đoạn gen có độ dài 316 bp; Kênh 3, 5, 7, 8 có kiểu gen TC do enzyme cắt tại một vị trí nên kiểu gen này có các đoạn như sau: 316 bp, 256 bp và 60 bp. Kênh 4, 6 có kiểu gen CC do enzyme cắt tại một vị trí cho ra các đoạn DNA: 256 bp và 60 bp. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Tần số alen và tần số kiểu gen Lpin1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giống Tổng số mẫu Tỷ lệ kiểu gen TT TC CC
mẫu % mẫu % mẫu %
Móng cái 97 0 0 15 15,5 72 74,5 M 1 2 3 4 5 6 7 8 500bp 256bp 316bp 60bp
Dựa vào bảng số liệu; kiểu gen TT, TC, CC đều xuất hiện ở Yorshire với tần số tương ứng là: 5,7%; 45,3%; 49% và ở lợn Móng Cái chỉ xuất hiện kiểu gen TC và CC với tần số tương ứng là: 15,5% và 17,5%. Như vậy kiểu gen Lpin1 ở lợn Yorshire là đa hình hơn lợn Móng Cái.
Kết quả này cũng tương tự như kết quả nghiên cứu của Zhao và cs (3/2008) [56], nghiên cứu trên 162 con lợn: Tong Cheng (42), Large White (25) và con lai Large White * (Landrace * Tong Cheng) (47), Landrace* (Large White * Tong Cheng) (48). Theo kết quả nghiên cứu thì kiểu gen CC có hàm lượng mỡ lá và mỡ giắt thấp hơn so với hàm lượng mỡ lá và mỡ giắt của lợn có kiểu gen TT, TC.
Đồ thị tần số kiểu gen Lpin1 của lợn Móng Cái (MC) và Yorshire (Y) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 TT TC CC Kiểu gen tỉ l ệ p h ần t răm MC Y
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1. Đã tách chiết DNA hệ gen từ mô tai lợn từ 53 mẫu Yorshire, và 97 mẫu Móng Cái. 150 mẫu mô tai lợn trên là một phần của bộ sưu tập mẫu, sử dụng phân tích nhiều gen khác nhau trong việc phát triển chỉ thị phân tử, hỗ trợ cho công tác chọn giống lợn lai.
2. Đã nhân đặc hiệu đoạn gen Lpin1 có kích thước 316 bp, và đoạn gen H- FABP có độ dài 816 bp.
3. Phân tích đa hình gen H-FABP bằng enzyme HaeIII RFLP cho kết quả: * Ở lợn Yorshire: + 37,7% cá thể mang kiểu gen đồng hợp DD (n=20) +54,7% cá thể mang kiểu gen dị hợp Dd (n=29) + 7,6% cá thể mang kiểu gen đồng hợp dd (n=4) * Ở lợn Móng Cái: + 99% cá thể mang kiểu gen đồng hợp DD (n=96) + 1% cá thể mang kiểu gen dị hợp Dd (n=1)
+ 0% cá thể mang kiểu gen đông hợp dd (n=0) 4. Phân tích đa hình gen Lpin1 bằng MspI RFLP cho kết quả: * Ở lợn Yorshire: + 5,7% cá thể mang kiểu gen đồng hợp TT (n=3) + 45,3% cá thể mang kiểu gen dị hợp TC (n=24) + 49% cá thể mang kiểu gen đồng hợp CC (n=26) * Ở lợn Móng Cái: + 0% cá thể mang kiểu gen đồng hợp TT (n=0) + 15,5% cá thể mang kiểu gen dị hợp TC (n=15) +74,5% cá thể mang kiểu gen đồng hợp CC (n=72)
Đây là kết quả bước đầu làm cơ sở nghiên cứu đánh giá mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình .
2. ĐỀ NGHỊ
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đưa ra một số đề nghị sau:
* Đánh giá sự tương quan giữa kiểu gen và hàm lượng mỡ giắt dựa trên mô hình lai phân tích.
* Phát triển chỉ thị phân tử gen H-FABP và Lpin1, sử dụng tiên đoán sớm chất lượng thịt của những con lợn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Đậu Hùng Anh, Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Thu Thúy, Lê Thị Phương Thảo, Nguyễn Văn Đức, Nguyễn Đăng Vang (2002), Xác định tần xuất các kiểu gen RYR-1 trong một số giống lợn bằng kỹ thuật PCR-RFLP. Tạp chí di truyền học và ứng dụng, (4), tr.26- 30.
2. Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Đậu Hùng Anh, Nguyễn Kim Độ (2003), Nghiên cứu đa hình gen một số giống lợn Việt Nam, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, tr.852-857.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1997), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Hà Nội. 4. Văn Lệ Hằng (1998), Nghiên cứu một số đặc điểm di truyền chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh có liên quan đến khả năng kháng bệnh của lợn nội (Móng Cái) và lợn ngoại (Yorshire và Landrace) nuôi ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội.
5. Lê Đình Lương (2001), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, Nxb Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
6. Nguyễn Ngọc Tuân, Trần Thị Dân, Lê Thanh Hiền, Ngụ Tiến Dũng, Châu Thanh Trúc (2001), Tần số gen Halothane và ảnh hưởng của gen này lên sức tăng trưởng, phẩm chất quày thịt và khả năng sinh sản của lợn tại các trại ở TPHCM, tóm tắt báo cáo khoa học hội nghị sinh học phân tử và hóa sinh, 25- 29/6/2001, TpHCM.
7. Tạ Thị Thoa, Trần Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Văn Cường, Đặng Thị Thu Thảo, Nguyễn Vân Anh (2009). Phân tích đa hình di truyền gen liên quan đến chất lượng thịt (RYR-1, H-FABP) lợn Móng Cái, Landrace và các con lai F1, F2. Tóm tắt báo cáo hội nghị hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm. Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, tháng 10-2008, tr.413-415.
8. Nguyễn Thu Thúy, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Văn Cường (2005). Phân tích đa hình trình tự đoạn gen mã hóa heart fatty acid- binding protein của một số giống lợn ở Việt Nam. Tạp chí di truyền ứng dụng. 9. Nguyễn Thị Diệu Thúy, Geldermann H. (2004), Đa hình di truyền một số giống lợn nội Việt Nam và Châu Âu dựa trên chỉ thị Microsatelite, Tạp chí khoa học tự nhiên và công nghệ, (4), tr.1-10.
10. Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Thu Thúy, Nguyễn Văn Cường, A.W.Kuss.H. Geldermann (2004). Đa hình gen hormone kích thích bao noãn (FSH) trong một số giống lợn ở Việt Nam. Di truyền học ứng dụng, (1), tr.14- 18.
11. Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thu Thúy, Nguyễn Đăng Vang, Phạm Anh Tuấn (2003). Phát triển chỉ thị di truyền đối với các tính trạng có ý nghĩa kinh tế phục vụ chọn giống động vật. Báo cáo khoa học hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2003, tr.1238-1243.
TIẾNG ANH
12. Anderson L. (2001), Genetic dissection of phenotypic diversity in farm animals, Nature Review Genetic, 2, pp.130-138. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
13. Carman G.M., and Han G.S. (2009), Phosphatidic acid phosphatase, a key enzyme in the regulation of lipid synthesis. J. Biol. Chem. 284, pp.2593-2597. 14. Chmurzyruska A. (2006), The multigene family of fatty acid-binding proteins (FABPs): Function, structure and polymorphism, J. Appl. Genet. 47(1), pp.39-48.
15. Crovetii and et al. (2007), Assessment of variability of genes associated with meat quality trait in Cinta Senese pigs, Ital. J. Animal.Sci. 6(1), pp.101. 16. Coleman R.A. and Lee D.P. (2004), Enzymes of triacylglycerol synthesis and their regulation, Prog. Lipid Res. 43, pp.134-176.
17. Huyen L.T.T., Roessler R., Lemke U., Zorate A.V. (2005), Impact of the use of exotic compared to local pig breeds on socio-economic development and biodiversity in Vietnam, VERLAG GRAUER, Beuren, Stuttgart, pp.3-5. 18. Donkor J., Sariahmetoglu M., Dewald J., Brindley D.N and Reue K. (2007), Three mammalian lipins act as phosphatidate phosphatases with distinct tissue expression patterns, J. Biol. Chem. 282, pp.3450-3457.
19. Gerbens F., Rettenberger G., Lenstra J.A., Veerkamp J.H., Tepas M.F.W. (1997), Characterization, chromosomal localization, and genetic variation of the porcine heart fatty acid-binding protein gene, Mamm Genome, 8, pp.328- 332.
20. Gerbens F., Van Erp A.J.M., Harder F., Meuwissen T.H.E. (1998), The adipocyte fatty acid- binding protein locus: characterization and association with intramuscular fat content in pig, Mamm Genome, 9, pp.1022- 1026.
21. Gerbens F., Koning D.J., Harder F.L., Meuwissen T.H., Janss L.L., Groenen M.A., Veerkamp J.H., Van Arendonk J.A. and Pas M.F. (2000), The effect of adipocyte and heart fatty acid-binding protein genes on intramuscular fatand backfat content in Meishan crossbred pigs, J.Anim. Sci.
78, pp.552-559.
22. Han G.S., Wu W.I and Carman G.M. (2006), The Saccharomyces cerevisiae Lipin homolog is a Mg2+ dependent phosphatidate phosphatase enzyme, J. Biol. Chem. 281, pp.9210-9218.