2. Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tà
2.2.4.Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Nguyên tắc
Phản ứng PCR là phản ứng khuyếch đại một đoạn DNA đích. Phản ứng dựa trên khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro
theo nguyên tắc bổ sung. Nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Plu polymease, Vent polymease) hoạt động theo nguyên tắc phức hợp mồi - khuôn, trong một môi trường thích hợp khi có các dNTPs thì sẽ kéo dài đoạn mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn hình thành nên các đoạn DNA, các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn, sau n chu kỳ phản ứng sẽ có 2n
bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi [3, 5].
Vì vậy khi tiến hành phản ứng PCR cần biết được trình tự 2 đầu của đoạn DNA cần khuyếch đại để thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu tương ứng.
* Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR diễn ra qua 3 giai đoạn hay là một chu kỳ:
- Giai đoạn biến tính DNA khuôn: ở nhiệt độ 920C đến 960C, hai sợi của chuỗi xoắn kép DNA tách rời nhau và do đó bộc lộ vị trí gắn mồi đặc hiệu cho đoạn DNA đích.
- Giai đoạn gắn mồi: Khi nhiệt độ phản ứng giảm xuống đến nhiệt độ thích hợp (470C đến 700C) mồi sẽ liên kết với DNA đích theo nguyên tắc bổ sung.
- Giai đoạn kéo dài mồi nhờ enzyme DNA polymerase: Nhiệt độ được nâng lên 720C là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme Taq DNA polymerase hoạt động kéo dài đoạn mồi tổng hợp mạch DNA mới bổ sung với sợi DNA đích.
Phản ứng PCR còn nhiều chu kỳ kế tiếp. Trong phản ứng này có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng và tính đặc hiệu của sản phẩm. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát một số thành phần và điều kiện phản ứng PCR, trong đó quan trọng nhất là hai yếu tố nồng độ Mg2+
và nhiệt độ gắn mồi.
Phản ứng PCR nhân đặc hiệu đoạn gen H-FABP và Lpin1 có thành phần và chế độ nhiệt thích hợp được trình bày trong bảng 2.6 và 2.7.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR của gen H-FABP và Lpin1
Thành phần Thể tích, thành phần phản ứng PCR (µl) H-FABP Lpin1 H2O 16,2 18,7 Đệm PCR 10x 2,5 2,5 MgCl2 (25mM) 2,0 0,5 dNTP (25mM) 0,2 0,2 Mồi xuôi (10pM) 1,0 1,0 Mồi ngược (10PM) 1,0 1,0
Taq DNA polymerase (10u/ml)
0,1 0,1
DNA khuôn 1,0 1,0
Tổng 25 25
Chú ý: Khi tiến hành phản ứng PCR các bước tiến hành và các hóa chất phải được giữ trong đá lạnh để đảm bảo hoạt tính sinh học của các hợp chất.
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng PCR của gen H-FABP và Lpin1 Bƣớc Chu trình nhiệt phản ứng PCR H-FABP Lpin1 Nhiệt độ (0C)
Thời gian Nhiệt độ (0C)
Thời gian
1.Biến tính toàn bộ DNA
94 4 phút 94 3 phút
2.Biến tính DNA 94 45 giây 94 30 giây
3.Gắn mồi 57 1 phút 55 30 giây
4.Tổng hợp 72 1 phút 72 30 giây
5. Lặp lại chu kỳ từ bước 2 đến bước 4, 35 chu kỳ 6.Hoàn thành quá
trình tổng hợp
72 10 phút 72 5 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7. Bảo quản 4 ∞ 4 ∞
* Sau khi tiến hành xong phản ứng PCR, sản phẩm sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
2.2.5. Phƣơng pháp phân tích đa hình đoạn cắt giới hạn (RFLP) Nguyên tắc
Enzyme giới hạn (RE-Restriction enzymes) là nhóm endonuclease chỉ cắt phân tử DNA mạch kép ở những vị trí (trình tự) xác định mà chúng có khả năng nhận ra. Thuộc tính rất quan trọng này của enzyme cho phép cắt phân tử DNA ở các vị trí tồn tại sẵn.
Mỗi enzyme giới hạn hoạt động tối ưu trong những điều kiện phản ứng thích hợp như: nhiệt độ, dung dịch có chứa các ion kim loại và pH nhất định. Nên tiến hành trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa enzyme - cơ chất. Tuy nhiên, phải đảm bảo cho thể tích
RE không vượt quá 1/10 thể tích phản ứng vì RE được bảo quản trong dung dịch đệm chứa 50% glycerin (glyceryl có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme) [3].
Các đoạn DNA nhất định khác nhau về trình tự nucleotit sẽ được các enzyme giới hạn nhận biết tại các vị trí khác nhau phù hợp với vị trí cắt của enzyme đó. Sự khác biệt về trình tự nucleotit giữa các đối tượng nghiên cứu sẽ dẫn đến việc thêm vào hay bớt đi các vị trí của enzyme giới hạn. Do đó sẽ tạo ra các đoạn đa hình có kích thước khác nhau và các đoạn DNA đặc trưng này sẽ bị phát hiện trên các bản điện di. Dựa vào sự khác nhau của các đoạn DNA mà có thể dùng để xác định kiểu gen của các mẫu nghiên cứu.
Phương pháp này thường được dùng để xác định đa hình di truyền, phân loại, xác định các điểm đột biến. Các enzyme giới hạn có thể phát hiện các đột biến đặc hiệu trong gen do sự thay đổi trình tự nucleotit, thông qua đó giúp chúng ta xác định được các alen trong kiểu gen của cá thể. Phân biệt các alen trội lặn, kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR
Thành phần H-FABP / HaeIII (µl) Lpin1 / MspI (µl)
H2O khử ion 1,5 2 Dung dịch đệm 2,5 2,5 Sản phẩm PCR 15 15 Enzyme giới hạn (5 u/µl) 1 0,5 Tổng thể tích 20 20
* H-FABP cắt bởi enzyme HaeIII được ủ qua đêm ở nhiệt độ 370C, Lpin1 cắt bởi enzyme MspI được ủ qua đêm ở nhiệt độ 560
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu mô tai lợn
DNA đã được tách từ 150 mẫu mô tai lợn như đã được miêu tả trong phần vật liệu và phương pháp. Sản phẩm DNA tách ra được kiểm tra, đánh giá bằng điện di trên gel agarose và đo quang phổ. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose 1% được trình bày trên hình 3.1.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm DNA tách chiết từ mô tai lợn
Trên hình 3.1 cho thấy các phân tử DNA có phân tử lượng lớn, tập trung thành một băng vạch chính và rõ nét, chứng tỏ DNA tách chiết là không lẫn tạp. Một vài sản phẩm chạy thành vệt sáng mờ, là do DNA bị đứt gãy, tuy nhiên không nhiều và không ảnh hưởng tới phản ứng PCR, nhất là với những cặp mồi đặc hiệu.
Các mẫu DNA được định lượng chính xác bằng máy đo quang phổ. Kết quả hấp thụ tử ngoại của 1 mẫu DNA được trình bày ở hình 3.2.
Hình 3.2. Phổ hấp thụ tử ngoại của DNA của lợn Móng cái và Yorshire
Kết quả : OD260 nm/OD280 nm =1,84.
Các mẫu có tỷ số OD260 nm/OD280 nm đạt trong khoảng 1,68 – 1,86 là đảm bảo độ tinh sạch.
Nồng độ DNA (μg/ml) được tính theo công thức trong phần phương pháp nghiên cứu, với độ pha loãng 100 lần. Sự khác biệt về số lượng và chất lượng DNA hệ gen tách chiết từ các mẫu có thể giải thích là do thao tác trong quá trình tách chiết, lượng sản phẩm DNA thu được không hoàn toàn giống nhau. Tuy nhiên, chất lượng và số lượng DNA hệ gen tách chiết bằng phương pháp của chúng tôi đạt được yêu cầu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phƣơng pháp PCR-RFLP 3.2.1. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phƣơng pháp PCR
Dựa trên trình tự gen H-FABP được công bố trên ngân hàng gen GenBank- Y15180 để thiết kế cặp mồi dùng cho phản ứng PCR. Đoạn gen H- FABP được nhân lên có kích thước phù hợp với lý thuyết là 816 bp, bắt đầu từ vị trí nucleotit 1401 đến vị trí số 2216 của intron thứ 2. Trong quá trình
điều kiện tối ưu nên đạt kết quả tốt. Kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di được thể hiện ở hình 3.3.
500bp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen H-FABP.
M: chỉ thị DNA 100 bp; 1-5: sản phẩm PCR nhân đoạn gen H-FABP
Nhìn vào điện di đồ cho ta thấy, sản phẩm PCR xuất hiện tập trung và rõ nét thành một băng duy nhất ứng với ví trí có kích thước 816 bp và không thấy xuất hiện băng phụ, phù hợp với tính toán lý thuyết.
Như vậy, đoạn gen H-FABP đã được nhân lên một cách đặc hiệu. Sản phẩm PCR thu được có chất lượng tốt phục vụ cho việc phân tích đa hình gen
H-FABP.
3.2.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng enzyme cắt giới hạn HaeIII
Gen H-FABP đã được đọc trình tự và xác định đa hình độ dài đoạn giới hạn HaeIII, HinfI, MspI bởi Gerbens và cs, (1997) [19]. Cả 3 vị trí RFLP của gen H-FABP đã được xác định là đa hình ở hầu hết các giống lợn được nghiên cứu bởi Gerbens và cs, (1998) [20]. Và ở các giống lợn Trung Quốc như: Nanchang white, Erhualian, Yushan black pig, Leping, Jinhua và Shanggao
M 1 2 3 4 5
1kb
bởi Lin W.H và cs, (2002) [32]. Neijiang, Rongchang, Bamei, Hanjiang Black, Hanzhong White của Pang W.J và cs, (2006) [41].
Bảng tần số các alen ở cả 3 vị trí RFLP của gen H-FABP của một số giống lợn của Gerbens và cs, (1998) [20].
Bảng 3.1. Tần số các alen ở cả 3 vị trí RFLP của gen H-FABP của một số giống lợn RFLP Tần số alen alen DL DU GY HS ME PI WP MspI A 0,98 0,4 0,81 1,0 1,0 0,9 0,7 a 0,02 0,6 0,19 0 0 0,1 0,3 HaeIII D 0,32 0,4 0,31 1,0 1,0 0,5 0,1 d 0,68 0,6 0,69 0 0 0,5 0,9 HinfI H 0,7 0,7 0,97 0,67 0,45 0,7 0,9 h 0,3 0,3 0,03 0,33 0,55 0,3 0,1
Ductch Landrace (DL), Duroc (DU), Great Yorshire (GY), Hampshire (HS), Meishan (ME), Pietrain (PI), Wild pig (WP)
Ở Việt Nam Nguyễn Thu Thúy (2005) [8] đã đọc trình tự đoạn gen H- FABP của một số giống lợn ở Việt Nam và đã tìm ra đoạn gen H-FABP được nghiên cứu chứa 3 điểm cắt giới hạn của enzyme HaeIII (Trình tự nhận biết là GG CC) tại vị trí 1517, 1533 và 1811. Trong đó, có một điểm đột biến đa hình tại vị trí 1811, ở đó base guanine (G) bị thay thế bằng base cytosine (C). Khi HaeIII cắt đoạn gen H-FABP tại 3 vị trí trên sẽ tạo ra các đoạn DNA có kích thước 16 bp, 117 bp, 278 bp, 405 bp, tương ứng với kiểu alen d. Khi xảy ra đột biến thay thế base G bằng base C tại vị trí 1811 sẽ làm thay đổi trình tự nhận biết của enzyme HaeIII nên đoạn gen H-FABP chỉ bị cắt tại vị trí 1517 và 1533. Do đó, sản phẩm cắt đoạn gen H-FABP sẽ gồm các DNA có kích
Bảng 3.2. Các điểm cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H-FABP
Allele Vị trí Base Độ dài đoạn cắt (bp)
D 1517, 1533 G, G 683/117/16
d 1517, 1533, 1811 G, G, G 405/278/117/16
Sơ đồ vị trí cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H-FABP
117 bp HaeIII 16 bp HaeIII 683 bp Alen D GG CC GG CC
117 bp HaeIII 16 bp HaeIII 287 bp HaeIII 405 bp Alen d GG CC GG CC GGCC
Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR nhân đoạn gen H-FABP nhờ cặp mồi được thiết kế đặc hiệu, khuôn DNA, các chất cần thiết và các bước miêu tả chi tiết như phần phương pháp nghiên cứu, sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme HaeIII. Kết quả phân tích đa hình RFLP gen H-FABP với enzyme
HaeIII thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen H-FABP bằng enzyme
HaeIII 500bp 683bp 405bp 287bp 117bp 60bp 5 4 3 2 1 M 816bp
M: chỉ thị DNA 100 bp, 1- sản phẩm PCR; 2-5 sản phẩm cắt đoạn gen H- FABP. Trong đó giếng 2- kiểu gen dd; giếng 3, 4- kiểu gen Dd; giếng 5- kiểu gen DD.
Quan sát trên điện di đồ thể hiện ở hình 3.4 thấy rằng, sản phẩm cắt của đoạn gen H-FABP bởi enzyme HaeIII gồm các đoạn DNA có kích thước khác nhau, phù hợp với tính toán lý thuyết: Kênh 1 chỉ xuất hiện một băng có kích thước 816 bp đó là sản phẩm PCR của gen H-FBBP; Kênh 2 có kiểu gen dd, do chỉ có 1 alen bị cắt bởi enzyme HaeIII thành 4 đoạn có kích thước: 405 bp, 287 bp, 117 bp và 16 bp. Kênh 3, 4- kiểu gen Dd, do cả 2 alen D và d đều bị cắt bởi enzyme hình thành các đoạn:
683 bp, 405 bp, 287 bp, 117 bp, 60 bp. Kênh 5 có kiểu gen DD, do bị cắt bởi enzyme hình thành các đoạn: 683 bp, 117 bp và 60 bp.
Bảng 3.3. Kết quả phân tích đa hình RFLP kiểu gen H-FABP bằng enzyme HaeIII. Giống Tổng số mẫu Tỷ lệ kiểu gen DD Dd dd (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mẫu % mẫu % mẫu %
Móng cái 97 96 99 1 1 0 0
Yorshire 53 20 37,7 29 54,7 4 7,6
Kết quả phân tích cho thấy lợn Móng Cái chỉ có kiểu gen DD và Dd, trong đó DD (99%) cao hơn nhiều kiểu gen Dd (1%). Đa hình RFLP ở gen H- FABP ở lợn Yorshire cao hơn giống lợn nội với 3 kiểu gen: DD, Dd, dd tần suất tương ứng là: 37,7%, 54,7%,7,6%. Điều này chứng tỏ rằng, tỷ lệ xảy ra đột biến ở vị trí 1811 ở lợn Móng Cái thấp hơn ở lợn Yorshire.
đó, thấy lợn mang kiểu gen aa/dd/HH có hàm lượng mỡ trong mô cao nhất [8]. Theo nghiên cứu của Pang và cs (2006) [41] trên lợn Duroc, Large White, Landrace, Neijiang, Rongchang, Banmei pig, Hanjiang Black, Hanzhong White và một số giống lợn địa phương thì kiểu gen của H-FABP có tương quan với hàm lượng mỡ cơ (P<0.05). Hàm lượng mỡ cơ tương ứng với các kiểu gen DD<Dd<dd: 2,27%<2,49%<2,91%. Như vậy kết quả nghiên cứu trên đối tượng lợn Móng Cái và Yorshire của chúng tôi tương ứng với các nghiên cứu trước.
Đồ thị tần số kiểu gen H-FABP của lợn Móng Cái (MC) và Yorshire (Y) 0 20 40 60 80 100 120 DD Dd dd kiểu gen tỉ lệ p hầ n tr ăm MC Y
3.3. Phân tích gen Lpin1 bằng phƣơng pháp PCR- RFLP 3.3.1. Phân tích gen Lpin1 bằng phƣơng pháp PCR
Để phân tích gen Lpin1 bằng PCR-RFLP ta tiến hành nhân đoạn gen
Lpin1 bằng phương pháp PCR sau đó cắt sản phẩm thu được bằng enzyme
MspI.
Sử dụng chu trình nhiệt và thành phần phản ứng PCR thích hợp như phần vật liệu và phương pháp, chúng tôi tiến hành nhân đoạn gen Lpin1. Theo trình tự Genbank EU 164847, đoạn gen được nhân lên có kích thước 316 bp được thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen Lpin1
M: Chỉ thị DNA 100 bp, 1-8: sản phẩm PCR nhân đoạn gen Lpin1
Kết quả hình 3.5 cho thấy, sản phẩm PCR là một băng tương đối rõ nét tương ứng với kích thước 316 bp và không xuất hiện băng phụ, phù hợp với tính toán lý thuyết. Như vậy với chu trình nhiệt và thành phần phản ứng thích hợp chúng tôi đã nhân thành công đoạn gen Lpin1. Sản phẩm PCR thu được có chất lượng tốt phục vụ cho việc phân tích đa hình gen Lpin1.
8 7 6 5 4 3 2 1 M
316bp
3.3.2. Phân tích gen Lpin1 bằng enzyme cắt giới hạn MspI
Đoạn gen Lpin1 được nhân lên bằng phương pháp PCR và được cắt với enzyme giới hạn MspI, sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose 2 % để kiểm tra kiểu gen.
Theo trình tự đoạn gen Lpin1 (Genbank EU164847) thì vị trí cắt, trình tự nhận biết của MspI, độ dài đoạn cắt và các dạng alen có thể xuất hiện được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Điểm cắt của MspI ở đoạn gen Lpin1
Alen Số điểm cắt Độ dài đoạn cắt (bp) Sản phẩm
cắt
T 0 316
C 1 256/60
Sơ đồ vị trí cắt của MspI trên đoạn gen Lpin1
316 bp Alen T CTGG
60 bp MspI 256 bp Alen C CCGG
Đoạn gen Lpin1 chứa trình tự nhận biết của enzyme MspI ở vị trí
(C CGG). Khi MspI cắt tại vị trí trên sẽ tạo ra hai đoạn DNA có kích thước phân tử tương ứng là 256 bp và 60 bp tạo thành alen C. Trường hợp trình tự base tại vị trí trên thay đổi (đột biến) thì đoạn DNA không bị cắt nên sản phẩm cắt là đoạn gen có kích thước 316 bp tạo thành alen T. Như vậy với 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});