2. Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tà
2.1.3.Máy móc, trang thiết bị
Các máy móc, trang thiết bị dùng trong nghiên cứu được thể hiện ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Thiết bị Hãng sản xuất (nƣớc)
Cân phân tích (electronic Balance) Kern (Đức) Đèn chiếu UV (UV-Visible Spectrophotometer) Probe Shimadzu (Nhật Bản) Máy PCR PT-100 MJ Rsearch (Mỹ) Hệ thống điện di DNA (Electrophoresis Systems)
Pharmacia Biotech (Thụy Điển)
Hệ thống chụp ảnh tự động Pharmacia Biotech (Thụy Điển
Lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc)
Tủ ổn nhiệt Memmnent (Đức)
Máy li tâm lạnh Biofuge (Mỹ)
Máy quang phổ Probe Shimadzu (Nhật Bản) Tủ lạnh sâu -200C Sanyo (Nhật Bản)
Các thiết bị khác (nồi khử trùng, tủ sấy…)
Trung Quốc
Máy Soxhlex Trung Quốc
Đũa thuỷ tinh, cốc, giấy lọc…. Trung Quốc
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Thu mẫu mô tai (n=150)
Tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen từ mẫu mô tai lợn
Xác định nồng độ và độ tinh sạch DNA bằng quang phổ kế, điện di trên gel agarose 1%
Khuyếch đại đoạn gen H-FABP và Lpin1
bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%
Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 2%
Xác định kiểu gen của H-FABP và Lpin1
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm
Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn: đoạn gen H-FABP (với HaeIII) đoạn gen Lpin1 (với MspI)
2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA từ mẫu mô tai lợn Nguyên tắc
Phương pháp tách chiết DNA dựa trên các tính chất lý hoá học đặc trưng của DNA và sự khác biệt so với các hợp chất hữu cơ khác như protein, lipid, ARN…trong tế bào để loại bỏ các tạp chất ra khỏi mẫu bằng các hoá chất, các đặc điểm vật lý khác nhau.
Tiến hành
Bƣớc 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sử dụng khoảng 20 mg/ mẫu mô tai lợn (được lấy ra từ ống bảo quản bằng cồn 700, trong -200C), để khô cồn trong không khí ở nhiệt độ phòng. Nghiền mẫu thành dạng bột mịn trong Nitơ lỏng, đảm bảo cho các tế bào tách rời nhau tạo điều kiện hoạt động cho các hoá chất, đồng thời nhờ hoạt động cơ học giúp phá vỡ màng tế bào.
Bổ sung 500 µl đệm phá tế bào có tác dụng phá màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra ngoài môi trường. Trong thành phần của đệm phá màng có chứa SDS và EDTA không chỉ giúp phá màng tế bào mà còn có khả năng ức chế hoạt động của nuclease, bảo đảm cho DNA không bị phân huỷ trong quá trình tách chiết.
Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không có bản chất DNA
Thêm 2,5 µl protease K (20 mg/ml) sau đó ủ trong thời gian 8-10 tiếng ở 560
C. Sử dụng protease K để cắt protein nằm trong nội bào hay liên kết với DNA.
Bổ sung 2 µl RNase (100 mg/ml) trong thời gian là 1 tiếng ở 370C, RNase để cắt các ARN.
Bổ sung 500 µl CH3COONH4 7,5 M trong thời gian 2 tiếng ở -200C, các muối amoni có tác dụng kết tủa các protein và các thành phần khác trong
dung dịch. Li tâm 13.000 rpm/phút, trong 30 phút ở 40
C, để lắng các phần kết tủa xuống dưới đáy. Thu dịch nổi và loại bỏ cặn. / 2 lần.
Bƣớc 3: Tủa DNA
Bổ sung ethanol tuyệt đối vào tủa DNA theo tỷ lệ 2:1 để trong thời gian 2 tiếng ở -200C. Sau đó li tâm với tốc độ 13.000 rpm/phút trong 30 phút ở 40C. Thu tủa.
Rửa tủa bằng 500 µl ethanol 700, ly tâm với tốc độ 13.000 rpm/phút trong 30 phút ở 40C, thu tủa. Để khô cồn trong không khí ở nhiệt độ phòng/ 2 lần. Hoà tan tủa bằng 100 µl TE và bảo quản ở 40C.
2.2.2. Phƣơng pháp kiểm tra DNA bằng điện di gel agarose
DNA sau khi được tách chiết, sản phẩm phản ứng PCR và sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn sẽ được kiểm tra bằng phương pháp chạy điện di.
Nguyên tắc
Ở pH trung tính, DNA tích điện âm nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodieste của các acid nucleic, nên khi chạy trong điện trường có điện thế và cường độ thích hợp, chúng sẽ chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường. Khi chạy điện di trên giá thể là agarose tuỳ thuộc vào kích thước, chiều dài đoạn DNA mà chúng sẽ phân tách thành các băng khác nhau trên bản gel điện di. Phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn phân tử có kích thước nhỏ.
Loại gel phổ biến là agarose, agarose được chiết suất từ tảo biển, nó bị nóng chảy trong dung dịch đệm ở nồng độ thích hợp, thường khoảng 0,3 - 2,0% (w/v), khi làm nguội, agarose đông lại thành gel, được dùng làm khuôn tra mẫu trong điện di [5].
Nồng độ gel phụ thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tách. Đoạn DNA có kích thước càng nhỏ đòi hỏi hàm lượng agarose
trong gel càng lớn và ngược lại. Bảng 2.5 dưới đây cho thấy mối tương quan giữa nồng độ agarose và độ lớn của các phân tử DNA cần phân tích.
Bảng 2.5. Tƣơng quan giữa nồng độ gel agarose và kích thƣớc đoạn DNA cần phân tích theo Sambrook và CS (1998) [54]
Hàm lƣợng agarose trong gel (% w/v) Kích thƣớc đoạn DNA cần phân tích (kb) 0,3 5-60 0,6 1-20 0,7 0,8-10 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-3 2,0 0,1-2 Tiến hành
Chuẩn bị agarose với nồng độ thích hợp để kiểm tra các sản phẩm. Agarose được hoà tan trong đệm TBE 1x, đun cho tan chảy trong lò vi sóng. Để nguội đến khoảng 400
C-500C, rót gel vào khay điện di đã cài sẵn lược,độ dày gel 3-5 mm, để khoảng 30 phút cho gel đông lại, rút lược ra. Đặt gel vào buồng điện di, đổ dung dịch TBE 1x ngập mặt bản gel 0,5-1 cm.
Lấy 10 µl DNA trộn với 2 µl Loading dye (có chức năng kéo mẫu xuống đáy giếng và chặn không cho mẫu chạy khỏi bản điện di). Sau đó tra mẫu vào các giếng cùng với chỉ thị DNA (100 bp) để ước lượng kích thước phân tử DNA và chạy điện di với hiệu điện thế là 100V.
Khi kết thúc điện di, bản gel sẽ được nhuộm bằng Ethidium bromide 1% (EtBr có khả năng liên kết với các base của nucleotid và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia tử ngoại) khoảng 15-20 phút, rửa nhẹ bằng nước
cất, các băng DNA sẽ được quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng của tia tử ngoại (254 nm). Quan sát và chụp ảnh gel bằng hệ thống chụp ảnh tự động.
2.2.3. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Nguyên tắc :
Dựa trên sự hấp thụ ánh sáng tia tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pirimidine mà người ta có thể định lượng DNA trong dung dịch.
Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260: Optical Density) của các mẫu đo tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA có mặt trong dung dịch, cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu.
Nồng độ của DNA được tính theo công thức sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CDNA (µg/ml) = OD260 x 50 (µg/ml) x Độ pha loãng.
Trong đó: 1 đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ DNA = 50 (μg/ml) Độ pha loãng là độ pha loãng mẫu trong quá trình đo.
Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA trong dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở bước sóng 280 nm (OD280). 280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các acid nucleic và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleic.
Độ tinh sạch của DNA được tính bằng tỷ số bước sóng 260 nm/280 nm. Một dung dịch nucleic được xem là sạch, không tạp nhiễm ARN và protein khi tỷ số OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 [3].
Tiến hành
Đối chứng 1 ml TE 1x
- Cuvette đối chứng: Lấy 1 ml TE 1x cho vào một cuvette để làm đối chứng. - Cuvette đo mẫu:
+ Trước tiên các mẫu được đưa về nồng độ là 50 μg/ml
+ Lấy 5 μl dung dịch DNA (50 μg/ml) cần định lượng hòa tan trong 495 μl TE 1x (pha loãng 100 lần). Sau đó đo OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm.
Từ các giá trị OD thu được ở 2 bước sóng, có thể tính nồng độ và độ tinh sạch của DNA theo công thức trên.
2.2.4. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)Nguyên tắc Nguyên tắc
Phản ứng PCR là phản ứng khuyếch đại một đoạn DNA đích. Phản ứng dựa trên khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro
theo nguyên tắc bổ sung. Nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Plu polymease, Vent polymease) hoạt động theo nguyên tắc phức hợp mồi - khuôn, trong một môi trường thích hợp khi có các dNTPs thì sẽ kéo dài đoạn mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn hình thành nên các đoạn DNA, các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn, sau n chu kỳ phản ứng sẽ có 2n
bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi [3, 5].
Vì vậy khi tiến hành phản ứng PCR cần biết được trình tự 2 đầu của đoạn DNA cần khuyếch đại để thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu tương ứng.
* Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR diễn ra qua 3 giai đoạn hay là một chu kỳ:
- Giai đoạn biến tính DNA khuôn: ở nhiệt độ 920C đến 960C, hai sợi của chuỗi xoắn kép DNA tách rời nhau và do đó bộc lộ vị trí gắn mồi đặc hiệu cho đoạn DNA đích.
- Giai đoạn gắn mồi: Khi nhiệt độ phản ứng giảm xuống đến nhiệt độ thích hợp (470C đến 700C) mồi sẽ liên kết với DNA đích theo nguyên tắc bổ sung.
- Giai đoạn kéo dài mồi nhờ enzyme DNA polymerase: Nhiệt độ được nâng lên 720C là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme Taq DNA polymerase hoạt động kéo dài đoạn mồi tổng hợp mạch DNA mới bổ sung với sợi DNA đích.
Phản ứng PCR còn nhiều chu kỳ kế tiếp. Trong phản ứng này có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng và tính đặc hiệu của sản phẩm. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát một số thành phần và điều kiện phản ứng PCR, trong đó quan trọng nhất là hai yếu tố nồng độ Mg2+
và nhiệt độ gắn mồi.
Phản ứng PCR nhân đặc hiệu đoạn gen H-FABP và Lpin1 có thành phần và chế độ nhiệt thích hợp được trình bày trong bảng 2.6 và 2.7.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR của gen H-FABP và Lpin1
Thành phần Thể tích, thành phần phản ứng PCR (µl) H-FABP Lpin1 H2O 16,2 18,7 Đệm PCR 10x 2,5 2,5 MgCl2 (25mM) 2,0 0,5 dNTP (25mM) 0,2 0,2 Mồi xuôi (10pM) 1,0 1,0 Mồi ngược (10PM) 1,0 1,0
Taq DNA polymerase (10u/ml)
0,1 0,1
DNA khuôn 1,0 1,0
Tổng 25 25
Chú ý: Khi tiến hành phản ứng PCR các bước tiến hành và các hóa chất phải được giữ trong đá lạnh để đảm bảo hoạt tính sinh học của các hợp chất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng PCR của gen H-FABP và Lpin1 Bƣớc Chu trình nhiệt phản ứng PCR H-FABP Lpin1 Nhiệt độ (0C)
Thời gian Nhiệt độ (0C)
Thời gian
1.Biến tính toàn bộ DNA
94 4 phút 94 3 phút
2.Biến tính DNA 94 45 giây 94 30 giây
3.Gắn mồi 57 1 phút 55 30 giây
4.Tổng hợp 72 1 phút 72 30 giây
5. Lặp lại chu kỳ từ bước 2 đến bước 4, 35 chu kỳ 6.Hoàn thành quá
trình tổng hợp
72 10 phút 72 5 phút
7. Bảo quản 4 ∞ 4 ∞
* Sau khi tiến hành xong phản ứng PCR, sản phẩm sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
2.2.5. Phƣơng pháp phân tích đa hình đoạn cắt giới hạn (RFLP) Nguyên tắc
Enzyme giới hạn (RE-Restriction enzymes) là nhóm endonuclease chỉ cắt phân tử DNA mạch kép ở những vị trí (trình tự) xác định mà chúng có khả năng nhận ra. Thuộc tính rất quan trọng này của enzyme cho phép cắt phân tử DNA ở các vị trí tồn tại sẵn.
Mỗi enzyme giới hạn hoạt động tối ưu trong những điều kiện phản ứng thích hợp như: nhiệt độ, dung dịch có chứa các ion kim loại và pH nhất định. Nên tiến hành trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa enzyme - cơ chất. Tuy nhiên, phải đảm bảo cho thể tích
RE không vượt quá 1/10 thể tích phản ứng vì RE được bảo quản trong dung dịch đệm chứa 50% glycerin (glyceryl có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme) [3].
Các đoạn DNA nhất định khác nhau về trình tự nucleotit sẽ được các enzyme giới hạn nhận biết tại các vị trí khác nhau phù hợp với vị trí cắt của enzyme đó. Sự khác biệt về trình tự nucleotit giữa các đối tượng nghiên cứu sẽ dẫn đến việc thêm vào hay bớt đi các vị trí của enzyme giới hạn. Do đó sẽ tạo ra các đoạn đa hình có kích thước khác nhau và các đoạn DNA đặc trưng này sẽ bị phát hiện trên các bản điện di. Dựa vào sự khác nhau của các đoạn DNA mà có thể dùng để xác định kiểu gen của các mẫu nghiên cứu.
Phương pháp này thường được dùng để xác định đa hình di truyền, phân loại, xác định các điểm đột biến. Các enzyme giới hạn có thể phát hiện các đột biến đặc hiệu trong gen do sự thay đổi trình tự nucleotit, thông qua đó giúp chúng ta xác định được các alen trong kiểu gen của cá thể. Phân biệt các alen trội lặn, kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR
Thành phần H-FABP / HaeIII (µl) Lpin1 / MspI (µl)
H2O khử ion 1,5 2 Dung dịch đệm 2,5 2,5 Sản phẩm PCR 15 15 Enzyme giới hạn (5 u/µl) 1 0,5 Tổng thể tích 20 20
* H-FABP cắt bởi enzyme HaeIII được ủ qua đêm ở nhiệt độ 370C, Lpin1 cắt bởi enzyme MspI được ủ qua đêm ở nhiệt độ 560
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu mô tai lợn
DNA đã được tách từ 150 mẫu mô tai lợn như đã được miêu tả trong phần vật liệu và phương pháp. Sản phẩm DNA tách ra được kiểm tra, đánh giá bằng điện di trên gel agarose và đo quang phổ. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose 1% được trình bày trên hình 3.1.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm DNA tách chiết từ mô tai lợn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trên hình 3.1 cho thấy các phân tử DNA có phân tử lượng lớn, tập trung thành một băng vạch chính và rõ nét, chứng tỏ DNA tách chiết là không lẫn tạp. Một vài sản phẩm chạy thành vệt sáng mờ, là do DNA bị đứt gãy, tuy nhiên không nhiều và không ảnh hưởng tới phản ứng PCR, nhất là với những cặp mồi đặc hiệu.
Các mẫu DNA được định lượng chính xác bằng máy đo quang phổ. Kết quả hấp thụ tử ngoại của 1 mẫu DNA được trình bày ở hình 3.2.
Hình 3.2. Phổ hấp thụ tử ngoại của DNA của lợn Móng cái và Yorshire
Kết quả : OD260 nm/OD280 nm =1,84.
Các mẫu có tỷ số OD260 nm/OD280 nm đạt trong khoảng 1,68 – 1,86 là đảm bảo độ tinh sạch.
Nồng độ DNA (μg/ml) được tính theo công thức trong phần phương pháp nghiên cứu, với độ pha loãng 100 lần. Sự khác biệt về số lượng và chất lượng DNA hệ gen tách chiết từ các mẫu có thể giải thích là do thao tác trong quá trình tách chiết, lượng sản phẩm DNA thu được không hoàn toàn giống nhau. Tuy nhiên, chất lượng và số lượng DNA hệ gen tách chiết bằng phương pháp của chúng tôi đạt được yêu cầu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phƣơng pháp PCR-RFLP 3.2.1. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phƣơng pháp PCR
Dựa trên trình tự gen H-FABP được công bố trên ngân hàng gen GenBank- Y15180 để thiết kế cặp mồi dùng cho phản ứng PCR. Đoạn gen H- FABP được nhân lên có kích thước phù hợp với lý thuyết là 816 bp, bắt đầu từ vị trí nucleotit 1401 đến vị trí số 2216 của intron thứ 2. Trong quá trình
điều kiện tối ưu nên đạt kết quả tốt. Kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di được thể hiện ở