CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Kết quả tổng hợp và khảo sát nanoliposome mPEG-Chol
3.2.1. Kết quả tổng hợp mPEG-Chol
Kết quả phân tích phổ FT-IR của mPEG5000-Chol:
đặc trưng của cả mPEG-NH2 và CCF ở 2900 cm-1 là dao động liên kết cộng hóa trị C-H của nhóm CH2 trên mPEG-NH2; ở 1177 cm-1 là dao động liên kết cộng hóa trị C-O-C trên mPEG-NH2; ở 2963 và 1472 cm-1 là dao động liên kết cộng hóa trị C-H của nhóm -CH2 và -CH3 trên CCF. Đặc biệt, phổ FT-IR cho thấy có sự dịch chuyển dao động liên kết của nhóm –CCOCl từ số sóng 1783 cm-1 về số sóng 1758 cm-1 là do phản ứng hình thành liên kết carbamate (NH2COOH) giữa CCF và mPEG-NH2.
Bảng 3.5. Kết quả phổ FT-IR của mPEG, mPEG-NPC, mPEG-NH2, CCF và mPEG-Chol
Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm
-1)
mPEG mPEG-NPC mPEG-NH2 CCF mPEG-Chol
a -CH2 2899 2900 2901 2900 b C-O-C 1120 1122 1123 1177 c -NO2 1471 d -C=O 1776 e -NHCOO- 1722 1758 f -CCOCl 1783
Qua bảng thống kê dữ liệu phổ của các chất (Bảng 3.5), có sự lặp lại các tín
hiệu dao động đặc trưng trên phân tử mPEG-NH2 ở vị trí a, b ln xuất hiện trong
phân tử mPEG-Chol sau khi tổng hợp. Sự dịch chuyển tín hiệu dao động ở vị trí f về vị trí e cho thấy sự hình thành liên kết carbamate từ phản ứng giữa CCF và mPEG- NH2.
Dữ liệu phổ FT-IR của 5 sản phẩm mPEG-Chol (mPEG550-Chol, mPEG1100-Chol, mPEG5000-Chol, mPEG10000-Chol và mPEG20000-Chol) được trình bày trong Phụ lục 2.
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của mPEG5000-Chol:
Thành phần và cấu trúc của mPEG-NPC được xác định qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz, D2O, ppm) (Phụ lục 3). Trên phổ 1H-NMR của mPEG trong mPEG-NPC xuất hiện tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 3,43
ppm là tín hiệu proton của nhóm methyl -CH3 (a, mũi đơn); ẟH = 3,63 – 3,86 ppm là tín hiệu proton methylene của nhóm -CH2-OCH2- (b, mũi đa). Đặc biệt, sự xuất
(c, mũi đa) và ẟH = 4,52 – 4,57 ppm là tín hiệu proton methylene của nhóm -CH2- O- NPC (d, mũi đa) liên kết trực tiếp với nhóm carbonate trên NPC. Sự xuất hiện của hai tín hiệu ở ẟH = 7,51 – 7,59 ppm (f, mũi đôi) và ẟH = 8,38 – 8,49 ppm (g, mũi đơi) là hai tín hiệu đặc trưng proton vịng thơm nhóm (-CH=CH-) của NPC. Từ phổ 1H-NMR ở Phụ lục 3 cho thấy đã tổng hợp thành công mPEG-NPC.
Phổ 1H-NMR của mPEG-NH2 (500 MHz, D2O, ppm) (Phụ lục 4) xuất hiện tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 3,43 ppm là tín hiệu proton của nhóm
methyl -CH3 (a, mũi đơn); ẟH = 3,63 – 3,86 ppm là tín hiệu proton methylene của nhóm -CH2-OCH2- (b, mũi đa); ẟH = 3,46 – 3,53 ppm là tín hiệu proton methylene của nhóm -CH2-NH- (i, mũi đơn). Proton methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate của NPC ở ẟH = 4,52 – 4,57 ppm (-CH2-O-NPC) (d, mũi đa) dịch chuyển về vùng ẟH = 4,24 – 4,32 ppm (-CH2-O-CO-EDA) (e, mũi đa), do phản ứng thay thế NPC bằng ethylenediamine.
tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 3,43 ppm là tín hiệu proton của nhóm
methyl -CH3 (a, mũi đơn); ẟH = 3,63 – 3,86 ppm là tín hiệu proton methylene của nhóm -CH2-OCH2- (b, mũi đa) của mPEG. Tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 1,00 ppm (m, mũi đơn); ẟH = 0,67 ppm (n, mũi đơn); ẟH = 0,83 – 0,87 ppm (p,q; mũi đa) và ẟH = 0,89 – 0,92 ppm (r, mũi đơi) là tín hiệu đặc trưng của cholesterol. Mất tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 3,46 – 3,53 ppm của nhóm -CO-NH- CH2-CH2-NH2 (i, mũi đơn) và chỉ cịn tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 3,16
– 3,20 ppm (h, mũi đơn) chứng tỏ rằng có sự liên hợp giữa mPEG-NH2 và cholesterol.
Dữ liệu phổ 1H-NMR theo Hình 3.2 được thống kê qua Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả phổ 1H-NMR của mPEG-NPC, mPEG-NH2 và mPEG-Chol
Vị
trí H H của nhóm
Độ dịch chuyển hóa học ( , ppm)ẟ
mPEG-NPC mPEG-NH2 mPEG5000-Chol
a -CH3 3,43 3,43 3,34 b -O-CH2-CH2- 3,63 – 3,86 3,63 – 3,86 3,58 – 3,64 c -CH2-CH2O-O- 3,87 – 3,94 3,87 – 3,91 3,77 d -CH2-O-NPC 4,52 – 4,57 e -CH2-O-CO- 4,24 – 4,32 4,20 f,g -CH=CH- (vòng thơm) 7,51 – 7,59 và 8,38 – 8,49 h CH2-NH2 3,16 – 3,20 3,27 i -CH2-NH- 3,46 – 3,53 k -NH-CH2-CH2-NH- 4,47 l -C=CH-CH2 5,35 m - CH2-CH-CH- 1,00 n - CH2-CH-CH- 0,67 o -CH-CH2-C=CH- 2,33 p,q - CH2-CH-(CH3)2 0,83 – 0,87 r - CH-CH2-C=CH- 0,89 – 0,92
Qua bảng thống kê dữ liệu phổ (Bảng 3.6) cho thấy sản phẩm tổng hợp mPEG-NH2 ngồi sự lặp lại các tín hiệu proton từ mPEG-NPC ở vị trí a, b, c cịn có sự xuất hiện thêm tín hiệu mới tại vị trí i, h và mất tín hiệu ở vị trí f, g do sự thay thế NPC từ mPEG-NPC thành mPEG-NH2. Sản phẩm mPEG-Chol được tổng hợp
tại vị trí h.
Dữ liệu phổ 1H-NMR của các sản phẩm mPEG-Chol còn lại (mPEG550- Chol, mPEG1100-Chol, mPEG10000-Chol và mPEG20000-Chol) được thống kê qua Phụ lục 5, Phụ lục 6, Phụ lục 7 và Phụ lục 8. Từ kết quả phổ FT-IR và phổ 1H- NMR cho thấy đã tổng hợp thành công mPEG-Chol với 5 khối lượng phân tử (mPEG550, mPEG1100, mPEG5000, mPEG10000 và mPEG20000).
3.2.2. Kết quả biến tính bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Chol và đánh giá tính chất vật liệu
3.2.2.1. Kết quả khảo sát các yếu tố lên q trình biến tính bề mặt nanoliposome
a. Kết quả khảo sát khối lượng phân tử mPEG
Kích thước và hệ số đa phân tán của nanoliposome được biến tính bề mặt bằng mPEG-Chol (SLP@mPEG-Chol) với 5 khối lượng phân tử mPEG khác nhau được trình bày trong Bảng 3.7. Dữ liệu kết quả DLS của các sản phẩm SLP@mPEG-Chol được thể hiện trong Phụ lục 9.
Bảng 3.7. Kết quả DLS và thế zeta của các sản phẩm SLP@mPEG-Chol
SLP@mPEG-Chol Kích thước hạt (nm) Hệ số đa phân tán (PDI) Thế zeta (mV) SLP@mPEG550-Chol 115,50 ± 2,88 0,228 ± 0,02 -84,00 ± 10,31 SLP@mPEG1100-Chol 120,72 ± 2,48 0,347 ± 0,031 -67,47 ± 6,54 SLP@mPEG5000-Chol 139,83 ± 6,02 0,245 ± 0,059 -63,83 ± 1,87 SLP@mPEG10000-Chol 195,40 ± 6,61 0,229 ± 0,012 -46,73 ± 0,29 SLP@mPEG20000-Chol 214,93 ± 1,50 0,405 ± 0,009 -40,17 ± 1,93
Kết quả DLS cho thấy sự phân bố kích thước trong khoảng từ 115,50 nm đến 214,93 nm và phụ thuộc vào khối lượng phân tử của mPEG được ghép với cholesterol (mPEG-Chol). Điều này chứng tỏ rằng có sự hình thành liposome thơng qua tương tác kỵ nước của lecithin, cholesterol, CTAB và mPEG-Chol. Trong môi trường nước, các phân tử này sẽ tự lắp rắp để hình thành liposome. Các kết quả này
của liposome do mPEG ưa nước sẽ càng cồng kềnh khi khối lượng phân tử càng tăng. Tổng hợp hệ nanoliposome biến tính PEG ứng dụng làm hệ mang thuốc điều trị ung thư, vì vậy, chúng tơi chọn mPEG5000-Chol có kết quả tổng hợp SLP@mPEG-Chol với kích thước hạt < 200 nm (kích thước lý tưởng cho hệ mang thuốc). Nghiên cứu cũng sử dụng mPEG5000 để tổng hợp vật liệu mPEG-CS và mPEG-Gel.
b. Kết quả khảo sát nồng độ mPEG-Chol
Trong khảo sát nồng độ mPEG-Chol, nanoliposome biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-Chol đã được sử dụng để nang hóa thuốc chống ung thư paclitaxel (PTX) và carboplatin (CAR). Kết quả DLE và DLC của 5 nồng độ mPEG-Chol được thể hiện trên Hình 3.3.
Hình 3.3. Hiệu suất mang thuốc (a) và khả năng mang thuốc (b) của hệ
SLP@mPEG-Chol ở các nồng độ mPEG-Chol
Kết quả trong Hình 3.3 cho thấy sự gia tăng nồng độ mPEG-Chol dẫn đến thay đổi hiệu suất nang hóa thuốc. Khi nồng độ mPEG-Chol tăng từ 2% lên 4%, DLE tăng dần từ 82,84% lên 87,48% đối với PTX và tăng từ 64,34% đến 70,30% đối với CAR. Tuy nhiên, DLE không tăng thêm mà giảm dần khi nồng độ mPEG- Chol tăng lên đến 10%. Kết quả này cho thấy rằng nồng độ mPEG-Chol có tác động
là cao nhất ở nồng độ mPEG-Chol là 4%. Liposome với nồng độ PEG cao hơn cho khả năng hòa tan nhiều hơn và lưu giữ trong máu lâu hơn so với liposome với nồng độ PEG thấp hơn hoặc không biến tính PEG [78]. Tuy nhiên, sự gia tăng nồng độ khả năng trên 5% có thể cản trở sự thâm nhập của thuốc trong quá trình chuẩn bị SLP@mPEG-Chol mang thuốc. Do đó, nồng độ mPEG-Chol 4% được sử dụng trong tổng hợp hệ nanoliposome biến tính PEG bằng mPEG-Chol.
3.2.2.2. Kết quả nang hóa thuốc
a. Kết quả phân tích phổ FT-IR
SLP@mPEG-Chol nang hóa PTX (PTX/SLP@mPEG-Chol) và CAR (CAR/SLP@mPEG-Chol) thông qua tương tác kỵ nước. Trong môi trường hydrat, nanoliposome mang thuốc tự lắp ráp nhờ vào tương tác kỵ nước. Trong đó, PTX sẽ nằm trong lớp đôi phospholipid và CAR sẽ nằm trong khoang nước của liposome.
Hình 3.4. Phổ FT-IR của SLP, mPEG-Chol, PTX/SLP@mPEG-Chol và
CAR/SLP@mPEG-Chol
Trên phổ FT-IR của PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol (Hình 3.4) cho thấy xuất hiện đồng thời các dao động đặc trưng của cả
dao động C-H của chuỗi acid béo trên lecithin của SLP; 2900 cm-1 là dao động hóa trị C-H của nhóm CH2, 1758 cm-1 của nhóm -NHCOO- và 1177 cm-1 của nhóm C- O-C trên mPEG-Chol.
1690 cm-1 là dao động C=C và 1278 cm-1 là dao động C-N trên PTX xuất hiện trên PTX/SLP@mPEG-Chol. Đặc trưng cho liên kết Pt-NH2 xuất hiện ở 1399 và 1392 cm-1 trên CAR đều xuất hiện trên CAR/SLP@mPEG-Chol [79].
Dữ liệu phổ FT-IR của SLP, mPEG-Chol, PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol theo Hình 3.4 được thống kê qua Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả phổ FT-IR của SLP, mPEG-Chol, PTX/SLP@mPEG-Chol và
CAR/SLP@mPEG-Chol Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm-1) SLP mPEG -Chol SLP@ mPEG- Chol PTX CAR PTX/SLP @mPEG- Chol CAR/SLP @mPEG- Chol a -CH2 2900 2913 2922 2913 b C-O-C 1177 1121 1111 1147 e -NHCOO- 1758 1788 1783 1754 g C-O- 1384 1303 1385 1303 1286 h C-H 2965 2987 2978 2954 i C=C 1690 1693 k C-N 1278 1294 l Pt-NH2 1399 - 1392 1441
Qua bảng thống kê dữ liệu phổ của các chất (Bảng 3.8) cho thấy sự lặp lại các tín hiệu dao động đặc trưng trên phân tử mPEG-Chol ở vị trí a, b, c và trên phân tử SLP ở vị trí e, f luôn xuất hiện trong phân tử PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol sau khi tổng hợp. Trong phổ đồ của PTX/SLP@mPEG-
SLP@mPEG-Chol. Phổ đồ của CAR/SLP@mPEG-Chol xuất hiện tín hiệu dao động tại vị trí i chứng tỏ đã nang hóa thành cơng CAR vào SLP@mPEG-Chol.
b. Kết quả TEM và DLS PTX/SLP@mPEG-Chol
Hình 3.5. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của
PTX/SLP@mPEG-Chol
Hệ nanoliposome biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-Chol với nồng độ đã khảo sát là 4% mang thuốc PTX cho kết quả kích thước hạt trung bình là 161,80 nm với hệ số đa phân tán là 0,364 ± 0,026 và thế zeta mang điện tích âm (-54,30 ± 1,40 mV). Hình dạng và hình thái của PTX/SLP@mPEG-Chol được quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua được thể hiện trong Hình 3.5.c. Kết quả TEM cho thấy PTX/SLP@mPEG-Chol có dạng hình cầu đồng nhất.
CAR/SLP@mPEG-Chol
Kết quả cho thấy kích thước trung bình của CAR/SLP@mPEG-Chol là 169,6 ± 0,5 nm với hệ số đa phân tán nhỏ (PDI < 0,05) và kiểu phân bố 1 đỉnh. Bên cạnh
vỡ hạt.
Hình 3.6. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của
CAR/SLP@mPEG-Chol
Đối với các hệ nano ứng dụng mang thuốc, kích thước hạt nhỏ hơn 200 nm được chứng minh là cho thời gian lưu thông dài trong hệ thống mạch máu. Bên cạnh đó, PDI từ 0,08 đến 0,7 cho biết hệ số đa phân tán ở mức trung bình và PDI dưới 0,3 là phân bố hẹp. Trong khi đó, giá trị tuyệt đối của thế zeta > 30 mV tốt hơn cho sự ổn định thể chất của keo [60,80]. Những kết quả này cho thấy rằng các hệ nanoliposome được biến tính bề mặt bằng mPEG-Chol có tiềm năng ứng dụng làm hệ mang thuốc điều trị ung thư.
3.2.2.3. Kết quả đánh giá độ ổn định trong huyết thanh
Kết quả khảo sát độ ổn định trong huyết thanh của PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol được thể hiện trong Hình 3.7.
PTX/SLP@mPEG-Chol (a, b) và CAR/SLP@mPEG-Chol (c, d) khi ủ với 50% FBS Kết quả khảo sát độ ổn định trong huyết thanh cho thấy rằng độ hấp thu của PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol có sự thay đổi trong 4 giờ đầu và duy trì ổn định trong 24 giờ tiếp theo. Trong khi đó, PTX/SLP và CAR/SLP cho thấy sự lắng cặn khi thời gian khảo sát tăng. Kết quả này cho thấy nanoliposome được biến tính PEG bằng mPEG-Chol làm tăng tính ổn định của hệ nanoliposome trong huyết thanh so với nanoliposome chưa biến tính.
3.2.2.4. Kết quả đánh giá khả năng phóng thích thuốc
và SLP@mPEG-Chol trong mơi trường PBS (pH 7,4) được thể hiện trong Hình 3.8.
Hình 3.8. Kết quả phóng thích thuốc PTX ngun liệu, PTX được nang hóa trong
SLP và SLP@mPEG-Chol trong mơi trường PBS (pH 7,4)
Kết quả cho thấy thuốc PTX ngun liệu được phóng thích với tốc độ nhanh hơn rất nhiều so với thuốc PTX được nang hóa trong nanoliposome và nanoliposome biến tính PEG. Trong 6 giờ đầu khảo sát, kết quả cho thấy có khoảng 55% PTX ngun liệu được phóng thích, trong khi chỉ có 18% PTX được phóng thích từ SLP và khoảng 13% PTX được phóng thích từ SLP@mPEG-Chol và duy trì tốc độ phóng thích đến 48 giờ khảo sát. Sau 48 giờ khảo sát, 18,11% PTX được phóng thích từ PTX/SLP@mPEG, 21,60% PTX được phóng thích từ PTX/SLP và 60,06% PTX ngun liệu được phóng thích. Từ kết quả phóng thích thuốc của PTX ngun liệu, PTX được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol cho thấy kiểu phóng thích đặc trưng theo hai giai đoạn: giai đoạn đầu phóng thích nhanh và giai đoạn thứ hai là phóng thích chậm và cuối cùng là khơng đổi. Sự phóng thích nhanh vào giai đoạn đầu được thấy ở PTX nguyên liệu. Quá trình thủy phân của liposome địi hỏi thời gian lâu hơn trong các điều kiện của thực nghiệm so với thuốc ngun liệu. Do đó, giai đoạn thứ hai của q trình phóng thích chậm được giải thích là do
được nang hóa ở giữa hai lớp màng.
Mơ hình động học phóng thích thuốc:
Các tham số giải phóng động học và hệ số hồi quy được tính tốn từ bốn mơ hình động học phóng thích thuốc in vitro của PTX ngun liệu và PTX được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol được trình bày trong Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của PTX nguyên liệu, PTX được
nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol thu được thơng qua mơ hình động học bậc khơng, mơ hình động học bậc một, mơ hình Higuchi và mơ hình Korsmeyer- Peppas Mơ hình bậc khơng Mơ hình bậc một Mơ hình Higuchi Mơ hình Korsmeyer- Peppas k0 R2 kf R2 kH R2 kK n R2 PTX 0,5081 0,5107 0,0030 0,5202 3,8331 0,6408 33,312 0,1750 0,7816 PTX/SLP 0,1883 0,5959 0,0010 0,6136 1,3745 0,7251 11,442 0,1875 0,8307 PTX/SLP@ mPEG- Chol 0,1178 0,6230 0,0006 0,6341 1,2381 0,7962 9,587 0,1761 0,9153
Từ kết quả trong Bảng 3.9, đối với mơ hình bậc khơng giá trị R2 của PTX là 0,5107, PTX/SLP là 0,5959 và PTX/SLP@mPEG-Chol là 0,6230. Mơ hình bậc một, giá trị R2 của PTX là 0,5202, PTX/SLP là 0,6136 và PTX/SLP@mPEG-Chol là 0,6341. Mơ hình Higuchi, giá trị R2 của PTX là 0,6408, PTX/SLP là 0,7251 và PTX/SLP@mPEG-Chol là 0,7962. Mơ hình Korsmeyer-Peppas, giá trị R2 của PTX là 0,7816, PTX/SLP là 0,8307 và PTX/SLP@mPEG-Chol là 0,9153. Đối với mỗi mơ hình động học tương ứng, dạng phóng thích của PTX được nang hóa trong cả hai hệ liposome là SLP và SLP@mPEG-Chol đều cho thấy mối tương quan cao