Hydrat hóa:
Trong điều kiện hóa chất thực tế có ở phịng thí nghiệm kết hợp với tham khảo tài liệu, nghiên cứu lựa chọn chất hoạt động bề mặt tween 80 để khảo sát bổ sung vào pha nước trong q trình hydrat hóa [58]. Tiến hành hydrat hóa ở nhiệt độ
Hình 2.3. Q trình hydrat hóa
Giảm kích thước tiểu phân:
Phương pháp hydrat hóa màng mỏng lipid thường tạo ra các hạt liposome đa lớp và có kích thước hạt lớn, do đó liposome sau bào chế cần được làm giảm kích thước hạt.
Hình 2.4. Q trình giảm kích thước tiểu phân liposome 2.3.1.2. Khảo sát các yếu tố lên quá trình tổng hợp nanoliposome
a. Khảo sát nhiệt độ chuyển pha của lecithin có nguồn gốc đậu nành
- Nhiệt độ cô quay và nhiệt độ hydrat hóa lớp màng lipid được xác định thơng qua nhiệt độ bắt đầu nóng chảy (Tm) và nhiệt độ chảy hồn tồn (Tf) của lecithin có nguồn gốc đậu nành bằng phân tích nhiệt quét vi sai DSC.
- Đánh giá kết quả: nhiệt độ cơ quay và nhiệt độ hydrat hóa được lựa chọn cao hơn Tm và nhỏ hơn Tf.
b. Khảo sát phương pháp giảm kích thước hạt
- Liposome sau tổng hợp được tiến hành làm giảm kích thước hạt bằng các phương pháp khảo sát:
Siêu âm (sử dụng thiết bị siêu âm Elma S 80 H): 30 phút.
Nén qua màng 100 nm (sử mini extruder-Avanti Polar Lipids): 10 lần. Kết hợp siêu âm và nén qua màng: siêu âm 30 phút, nén qua màng 10 lần.
- Đánh giá kết quả: dựa vào kết quả đánh giá cảm quan, kích thước hạt, hệ số đa phân tán của hệ liposome sau tổng hợp và sau 1 tuần bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC để lựa chọn phương pháp giảm kích thước cho hệ liposome. Phương pháp giảm kích thước hạt được lựa chọn là phương pháp cho hệ liposome sau bảo quản ổn định (không xuất hiện các hiện tượng kém bền: kết bơng, nổi kem, lắng cặn, tách lớp…) và kích thước hạt trung bình nhỏ hơn 200 nm.
c. Khảo sát tỷ lệ thành phần tạo liposome
- Khảo sát tỷ lệ lecithin:cholesterol: liposome được tổng hợp với các tỷ lệ lần lượt là 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:4 và 4:6 (khối lượng/khối lượng).
- Khảo sát tỷ lệ CTAB: tiến hành tổng hợp liposome theo phương pháp hydrat hóa lớp màng lipid với tỷ lệ lecithin:cholesterol được chọn và tỷ lệ CTAB khảo sát lần lượt là 0%, 1%, 2%, 3% và 4% khối lượng lipid [58].
- Khảo sát tỷ lệ chất hoạt động bề mặt (tween 80): tiến hành tổng hợp liposome theo phương pháp hydrat hóa lớp màng lipid với tỷ lệ lecithin:cholesterol và tỷ lệ CTAB được chọn. Tỷ lệ tween 80 được khảo sát lần lượt là 0%, 0,5%, 1,0%, 1,5% và 2,0% (khối lượng/thể tích).
- Đánh giá kết quả: dựa vào kết quả đánh giá cảm quan, kích thước hạt, hệ số đa phân tán của hệ liposome sau tổng hợp và sau 1 tuần bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC để lựa chọn tỷ lệ các thành phần tạo liposome. Tỷ lệ thành phần tạo liposome được lựa chọn là tỷ lệ cho hệ liposome sau bảo quản ổn định (không xuất hiện các hiện tượng kém bền: kết bông, nổi kem, lắng cặn, tách lớp…) và kích thước hạt trung bình nhỏ hơn 200 nm.
2.3.2. Phương pháp tổng hợp mPEG-cholesterol, mPEG-chitosan và mPEG-gelatin gelatin
Vật liệu mPEG-cholesterol, mPEG-chitosan được tổng hợp bằng cách sử dụng p-nitrophenyl chloroformate (NPC) để hoạt hóa mPEG và được phát triển từ phương pháp tổng hợp mPEG-gelatin của nhóm nghiên cứu [59].
2.3.2.1. Tổng hợp vật liệu mPEG-cholesterol (mPEG-Chol)
- NPC được sử dụng để hoạt hóa mPEG và ethylenediamine (EDA) được sử
có nhóm acyl chloride (-CCOCl) được sử dụng để phản ứng với nhóm amine (- NH2) của mPEG-NH2 tạo thành vật liệu mPEG-Chol.
- Quy trình tổng hợp vật liệu mPEG-Chol được thực hiện qua 3 giai đoạn: Tổng hợp mPEG-NPC:
mPEG-NPC được tổng hợp theo cơ chế thế thân hạch trên carbonyl. Tương tự như phản ứng ester hóa, liên kết CO trong cấu trúc của NPC có tính chất khơng no và bị phân cực mạnh về phía oxy, làm xuất hiện mật độ điện tích dương trên nguyên tử carbon, tạo ra trung tâm thiếu điện tử. Trong khi đó, trên nguyên tử oxy của nhóm -OH của phân tử mPEG cịn hai đơi điện tử tự do, nên nguyên tử oxy có vai trò như một tác nhân ái nhân. Trung tâm thiếu điện tử trên nguyên tử carbon của phân tử NPC gặp tác nhân ái nhân của phân tử mPEG sẽ tương tác với nhau tạo sản phẩm mPEG-NPC. Phản ứng diễn ra thuận lợi ở nhiệt độ 60 – 65ºC.
Hình 2.5. Phản ứng tổng hợp mPEG-NPC
Cân mPEG cho vào bình cầu 250 mL làm nóng chảy ở nhiệt độ 65oC trong mơi trường chân khơng khoảng 2 giờ để mPEG tan chảy hồn tồn. Sau đó cho NPC được vào bình cầu, khuấy ở nhiệt độ 65oC, mơi trường khí N2 trong 5 giờ. Giảm nhiệt độ xuống 40oC, cho 10 mL THF vào khuấy ở nhiệt độ phòng trong vòng 16 giờ để thu dung dịch mPEG-NPC.
Tổng hợp mPEG-NH2:
Khi có sự hiện diện của tác nhân thân hạch như nhóm amine (-NH2), phản ứng thay thế nhóm nitrophenolate sẽ xảy ra và hình thành liên kết urethane cùng sản phẩm phụ p-nitrophenol.
Hình 2.6. Phản ứng tổng hợp mPEG-NH2
Dung dịch mPEG-NPC được nhỏ từ từ vào dung dịch EDA. Phản ứng diễn ra trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp thu được đem kết tủa trong 500 mL diethyl ether và lọc hút chân khơng. Hịa tan tủa trong nước và thẩm thẩm tách bằng màng 3,5 kDa trong 72 giờ. Tiến hành đông khô thu sản phẩm thu mPEG-NH2 ở dạng bột, màu trắng mịn.
Tổng hợp mPEG-Chol:
Cholesteryl chloroformate (CCF) có nhóm acyl chloride (-COCl) được sử dụng để phản ứng với nhóm amine (-NH2) của mPEG-NH2 tạo thành vật liệu mPEG-Chol.
Hình 2.7. Phản ứng tổng hợp mPEG-Chol
Cân mPEG-NH2 và CCF cho vào cốc 100 mL. Sau đó, 50 mL chloroform được cho vào và phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
2.3.2.2. Tổng hợp vật liệu mPEG-chitosan (mPEG-CS)
- NPC được sử dụng để hoạt hóa mPEG trước khi tiến hành phản ứng với
dung dịch chitosan tạo thành vật liệu mPEG-CS.
- Quy trình tổng hợp vật liệu mPEG-Chol được thực hiện qua 3 giai đoạn: Tổng hợp mPEG-NPC:
Tương tự giai đoạn 1 của quy trình tổng hợp vật liệu mPEG-Chol (Mục
2.3.2.1)
Tạo dung dịch chitosan:
Chitosan (100000-300000 Da) được hòa tan vào nước cất, khuấy ở tốc độ 300 vòng/phút. Tiến hành nhỏ từng giọt dung dịch HCl 1M vào dung dịch chitosan sao cho pH dung dịch bằng 5. Khuấy ở tốc độ 300 vòng/phút cho đến khi chitosan tan hoàn toàn để thu được dung dịch chitosan.
Tổng hợp mPEG-CS:
Nhỏ từng giọt dung dịch mPEG đã hoạt hóa vào dung dịch chitosan, khuấy 300 vịng/phút trong 24 giờ. Dung dịch mPEG-CS được thẩm tách bằng màng (MWCO: 12-14 kDa) trong 4 ngày bằng nước cất. Tiến hành đông cô dung dịch mPEG-CS thu sản phẩm.
2.3.2.3. Tổng hợp vật liệu mPEG-gelatin (mPEG-Gel)
- NPC được sử dụng để hoạt hóa mPEG trước khi tiến hành phản ứng với
dung dịch gelatin tạo thành vật liệu mPEG-Gel.
- Quy trình tổng hợp các vật liệu mPEG-Gel được thực hiện qua 3 giai đoạn: Tổng hợp mPEG-NPC:
Tương tự giai đoạn 1 của quy trình tổng hợp vật liệu mPEG-Chol (Mục
2.3.2.1)
Tạo dung dịch gelatin:
Gelatin loại A (~300 g Bloom) được hòa tan vào nước cất, khuấy ở tốc độ 300 vòng/phút để thu được dung dịch gelatin.
Tổng hợp mPEG-Gel:
Nhỏ từng giọt dung dịch mPEG đã hoạt hóa vào dung dịch gelatin, khuấy 300 vòng/phút trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Dung dịch mPEG-Gel được thẩm tách bằng màng (MWCO: 12 – 14 kDa) trong 3 ngày bằng nước cất. Tiến hành đông khô thu sản phẩm.
2.3.2.4. Phương pháp đánh giá
Cấu trúc sản phẩm thu được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR và phổ hồng ngoại biến đổi FT-IR.
2.3.3. Phương pháp PEG hóa bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Chol, mPEG-CS và mPEG-Gel mPEG-CS và mPEG-Gel
2.3.3.1. Biến tính bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Chol
a. Quy trình biến tính bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Chol
Quy trình tổng hợp liposome (Mục 2.3.1) với các yếu tố khảo sát đạt yêu cầu về kích thước hạt được sử dụng để biến tính bề mặt bằng vật liệu mPEG-Chol.
b. Khảo sát các yếu tố lên q trình biến tính bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Chol
- Khảo sát khối lượng phân tử mPEG:
mPEG với 5 khối lượng phân tử (mPEG550, mPEG1100, mPEG5000, mPEG10000 và mPEG20000) được nghiên cứu tiến hành khảo sát để chọn ra loại mPEG có khối lượng phân tử phù hợp cho tổng hợp vật liệu mPEG-Chol.
Đánh giá kết quả: dựa vào kết quả kích thước hạt, hệ số đa phân tán và thế
zeta của nanoliposome sau tổng hợp để lựa chọn mPEG với khối lượng phân tử phù hợp cho tổng hợp vật liệu mPEG-Chol.
- Khảo sát nồng độ mPEG-Chol:
mPEG-Chol 2%, 4%, 6%, 8% và 10% được khảo sát để chọn ra nồng độ mPEG-Chol cho hiệu suất mang thuốc và khả năng mang thuốc của nanoliposome là cao nhất.
Đánh giá kết quả: dựa vào kết quả hiệu suất mang thuốc và khả năng mang
thuốc của hệ nanoliposome để chọn nồng độ mPEG-Chol.
2.3.3.2. Phủ bề mặt nanoliposome bằng mPEG-CS
a. Quy trình phủ bề mặt nanoliposome bằng mPEG-CS
Quy trình phủ bề mặt nanoliposome bằng mPEG-CS được thực hiện tương tự quy trình biến tính bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Chol.
mPEG-CS 2%, 4%, 6%, 8% và 10% được khảo sát để chọn ra nồng độ mPEG-CS cho hiệu suất mang thuốc và khả năng mang thuốc của nanoliposome là cao nhất.
Đánh giá kết quả: dựa vào kết quả hiệu suất mang thuốc và khả năng mang
thuốc của hệ nanoliposome để chọn nồng độ mPEG-CS.
2.3.3.3. Phủ bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Gel
a. Quy trình phủ bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Gel
Quy trình phủ bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Gel được thực hiện tương tự quy trình biến tính bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Chol.
b. Khảo sát các yếu tố lên quá trình phủ bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Gel mPEG-Gel 2%, 4%, 6%, 8% và 10% được khảo sát để chọn ra nồng độ mPEG-Gel cho hiệu suất mang thuốc và khả năng mang thuốc của nanoliposome là cao nhất.
Đánh giá kết quả: dựa vào kết quả hiệu suất mang thuốc và khả năng mang
thuốc của hệ nanoliposome để chọn nồng độ mPEG-Gel.
2.3.4. Phương pháp nang hóa thuốc vào nanoliposome đã biến tính
2.3.4.1 Phương pháp nang hóa thuốc paclitaxel vào nanoliposome đã biến tính
Quy trình nang hóa thuốc paclitaxel vào nanoliposome đã biến tính: Tạo lớp màng lipid:
Cân và hịa tan lecithin có nguồn gốc đậu nành, cholesterol, CTAB, vật liệu tổng hợp (mPEG-Chol/mPEG-CS/mPEG-Gel) và thuốc paclitaxel trong hỗn hợp dung môi CHCl3:MeOH.
Tiến hành cô quay áp suất thấp để loại dung mơi hữu cơ. Hydrat hóa:
Tiến hành hydrat hóa ở nhiệt độ được chọn trong khoảng 2 giờ. Giảm kích thước tiểu phân:
2.3.4.2 Phương pháp nang hóa thuốc carboplatin vào nanoliposome đã biến tính
Quy trình nang hóa thuốc carboplatin vào nanoliposome đã biến tính: Tạo lớp màng lipid:
Cân và hịa tan lecithin có nguồn gốc đậu nành, cholesterol, CTAB và vật liệu tổng hợp (mPEG-Chol/mPEG-CS/mPEG-Gel) trong hỗn hợp dung môi CHCl3:MeOH.
Tiến hành cô quay áp suất thấp để loại dung mơi hữu cơ. Hydrat hóa:
Hịa tan thuốc carboplatin vào dung dịch hydrat hóa đã được chọn. Tiến hành hydrat hóa ở nhiệt độ được lựa chọn trong khoảng 2 giờ. Giảm kích thước tiểu phân:
Tiến hành giảm kích thước tiểu phân bằng phương pháp được chọn.
2.3.5. Phương pháp đánh giá tính chất vật liệu
2.3.5.1. Phương pháp đánh giá cảm quan, kích thước hạt, hệ số đa phân tán và thế zeta
- Cảm quan: nanoliposome ổn định (không xuất hiện các hiện tượng kém bền: kết bơng, nổi kem, lắng cặn, tách lớp…).
- Kích thước, hệ số đa phân tán và thế zeta: được xác định bằng thiết bị Horiba Nano SZ100 tại Trung tâm phân tích Sinh-Hóa-Lý tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng Tp. Hồ Chí Minh.
Trong đó, hệ số phân tán (PDI) là một thông số quan trọng cho biết về sự phân bố kích thước hạt trong một mẫu nhất định. PDI nằm trong khoảng từ 0,0 (đối với mẫu hồn tồn đồng nhất về kích thước hạt) đến 1,0 (đối với mẫu có độ phân tán cao với nhiều kích thước hạt). PDI < 0,05 cho thấy mẫu đơn phân tán cao và PDI > 0,7 cho thấy rằng mẫu có phân bố kích thước hạt rất rộng và khơng thích hợp để phân tích bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS) [60]. PDI được tính theo cơng thức [61]:
PDI= (SD 2
d )
Cấu trúc nanoliposome được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (Tranmission Electron Microscope-TEM), điện thế gia tốc 100kV tại Phịng thí nghiệm trọng điểm polyme và compozit – Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh.
2.3.5.3. Phương pháp xác định cấu trúc vật liệu mPEG-Chol, mPEG-CS và mPEG-Gel
Cấu trúc sản phẩm thu được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR và phổ hồng ngoại biến đổi FT-IR. Thiết bị NMR (Bruker) được đặt tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, Hà Nội. Máy quang phổ FT-IR (PerkinElmer) được đặt tại viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ, Tp. Hồ Chí Minh.
2.3.5.4. Phương pháp đánh giá độ ổn định trong huyết thanh
Tính ổn định trong huyết thanh là một trong những thơng số chính để đánh giá khả năng ứng dụng in vivo của vật liệu mang thuốc. Hệ nanoliposome và nano liposome biến tính PEG mang thuốc được ủ trong mơi trường chứa 50% huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum, FBS) trong 24 giờ và được đo độ hấp thu tại các mốc thời gian khảo sát.
Phương pháp đo độ đục được sử dụng để đánh giá độ ổn định trong huyết thanh của các hệ nanoliposome tổng hợp [62,63]. Sự thay đổi độ đục được xác định bằng máy đọc hệ thống xét nghiệm miễn dịch bán tự động HumanReader HS (Human, Germany) tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ, Tp. Hồ Chí Minh.
2.3.5.5. Phương pháp xác định hiệu suất nang hóa (DLE) và khả năng mang thuốc (DLC)
a. Phương pháp định lượng paclitaxel bằng HPLC - Điều kiện:
Hệ thống: HPLC Flexar perkinElmer, Mỹ. Cột phân tích: C18 (4,6 mm x 12,5 cm; 5 µm). Đầu dị: Plexar PDA Plus
Bước sóng phát hiện: 214 nm
Pha tĩnh: Cột Zorbac Eclipse XPD C18 (250x4,6), kích thước hạt nhồi 5 μm. Pha động: Acetonitrile:Nước (95:5)
mL/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
- Định lượng paclitaxel được nang hóa vào nanoliposome: nanoliposome nang hóa paclitaxel được pha lỗng trong nước cất. Mẫu được ly tâm với tốc độ 16000 vòng/phút trong 30 phút. Paclitaxel tự do không tan trong nước ở dạng kết tủa được định lượng bằng HPLC.
b. Phương pháp định lượng carboplatin bằng ICP-MS - Điều kiện:
Hệ thống: PerkinElmer Nexion 2000, Mỹ
Chế độ và điều kiện phân tích: Standard Mode (Nebulizer Gas Flow 1,02; Plasma Gas Flow 15; Auxillary Gas Flow 1,2; tốc độ bơm nhu động 60 rpm); Analyte: Pt.
Sử dụng bộ tiêm mẫu tự động Autosampler, hao hụt thể tích trung bình 3 mL/mẫu/ lần đo.
- Định lượng carboplatin được nang hóa vào nanoliposome: carboplatin tự do sẽ được loại đi bằng thẩm tách qua màng trong 4 giờ bằng nước cất. Thuốc nang hóa và thuốc tự do sẽ được xác định bằng ICP-MS.
c. Phương pháp xác định DLE và DLC
Hiệu suất nang hóa thuốc: DLC% = mT-NH x100% mT-BĐ
Khả năng mang thuốc: DLE% = mT-NH x100% mT-NH + mCM
Trong đó:
• mT-NH : Khối lượng thuốc được nang hóa (mg)
• mT-BĐ : Tổng khối lượng thuốc ban đầu (mg)
• mCM : Khối lượng chất mang
d. Phương pháp đánh giá khả năng phóng thích thuốc
Quy trình phóng thích paclitaxel được thực hiện bằng cách cho nanoliposome biến tính PEG mang thuốc (100 mg) và thuốc nguyên liệu (cân lượng