Tỷ lệ tween 80
(%)
Sau tổng hợp Sau 1 tuần bảo quản ở 2 – 8oC
Cảm quan Kích thước (nm) PDI Cảm quan Kích thước (nm) PDI 0 Trong 208,8 ± 3,2 0,244 ± 0,032 Trong 203,3 ± 1,1 0,221 ± 0,014 0,5 Trong 177,0 ± 3,4 0,373 ± 0,006 Trong 169,4 ± 8,2 0,317 ± 0,042 1 Trong 177,9 ± 10,2 0,632 ± 0,040 Lắng cặn - - 1,5 Hơi đục - - Lắng cặn - -
tween 80 (%) Cảm quan Kích thước (nm) PDI Cảm quan Kích thước (nm) PDI 2 Hơi đục - - Lắng cặn - -
Kết quả khảo sát tỷ lệ tween 80 trong môi trường hydrat cho thấy với tỷ lệ là 0,5%, liposome cho cảm quan hỗn dịch sau bào chế trong và ổn định ở điều kiện 2 – 8oC sau một tuần bảo quản (Bảng 3.4.). Ở tỷ lệ tween 80 là 1%, hệ phân tán sau tổng hợp cho cảm quan hỗn dịch hơi đục và không ổn định. Tỷ lệ tween 80 trên 0,5% mặc dù cho cảm quan hỗn dịch sau bào chế trong nhưng bị sa lắng sau một tuần bảo quản. Điều này có thể được giải thích khi tăng nồng độ tween 80 sẽ giúp tăng giá trị tuyệt đối thế zeta của tiểu phân nano, tạo ra các tiểu phân nano tích điện cao, giúp giảm được sự tích tụ tiểu phân nano khi ở trạng thái trung tính. Tuy nhiên, khi nồng độ tween 80 tăng lên là 1%, 1,5% và 2,0% môi trường hydrat sẽ tạo thành nhiều cấu trúc hạt không mong muốn như thể micelle của chất diện hoạt. Bên cạnh đó, khi khơng có tween 80 sẽ dẫn tới bề mặt các tiểu phân nano không được bao phủ làm cho các tiểu phân được tạo ra sẽ bị kết tụ lại ngay dẫn đến khơng thể hình thành tiểu phân nano.
Kết quả nghiên cứu của đề tài tương đồng với nghiên cứu của Yan Chen (2012) khi nghiên cứu tổng hợp liposome mang thuốc từ phosphatidyl choline và cholesterol với nồng độ tween 80 là 0,5% trong 1 mL dung dịch hydrat hóa PBS pH 6,5. Kết quả nghiên cứu của Yan Chen thu được hệ liposome mang thuốc với kích thước trung bình 82,37 ± 2,19 nm, hệ số đa phân tán nhỏ 0,247 ± 0,028 và hiệu suất mang thuốc là 82,32 ± 3,91% [75]. Mặt khác, theo nghiên cứu tài liệu, khi làm giảm kích thước hạt lipsome đặc biệt là phương pháp đồng nhất hóa, hạt liposome lớn bị phá vỡ, tween 80 với vai trò là chất hoạt động bề mặt sẽ cản trở quá trình sát nhập của các tiểu phân và duy trì kích thước tiểu phân đã giảm. Như vậy kích thước hạt sẽ nhỏ đáng kể so với mẫu không dùng tween. Nhưng nhược điểm của tween 80 là khả năng tạo bọt. Nồng độ tween 80 càng cao thì khả năng tạo bọt càng lớn và gây trở ngại trong q trình đồng nhất hóa.
màng lipid trong tổng hợp liposome.
Kết luận: kết quả khảo sát các yếu tố lên quá trình tổng hợp nanoliposome
từ lecithin có nguồn gốc đậu nành cho thấy cần thiết phải giảm kích thước tiểu phân sau tổng hợp để thu được nanoliposome với kích thước 100 – 200 nm và ổn định.
Các yếu tố trong q trình tổng hợp nanoliposome từ lecithin có nguồn gốc đậu nành được nghiên cứu chọn như sau:
- Tỷ lệ lecithin:cholesterol: 9:1 (khối lượng/khối lượng) - Tỷ lệ CTAB: 1%
- Tỷ lệ tween 80: 0,5% - Nhiệt độ cô quay: 45oC. - Nhiệt độ hydrat hóa: 60oC.
- Phương pháp giảm kích thước hạt: siêu âm (30 phút) kết hợp nén qua màng 100 nm (10 lần).
3.2. Kết quả tổng hợp và khảo sát nanoliposome mPEG-Chol
3.2.1. Kết quả tổng hợp mPEG-Chol
Kết quả phân tích phổ FT-IR của mPEG5000-Chol:
đặc trưng của cả mPEG-NH2 và CCF ở 2900 cm-1 là dao động liên kết cộng hóa trị C-H của nhóm CH2 trên mPEG-NH2; ở 1177 cm-1 là dao động liên kết cộng hóa trị C-O-C trên mPEG-NH2; ở 2963 và 1472 cm-1 là dao động liên kết cộng hóa trị C-H của nhóm -CH2 và -CH3 trên CCF. Đặc biệt, phổ FT-IR cho thấy có sự dịch chuyển dao động liên kết của nhóm –CCOCl từ số sóng 1783 cm-1 về số sóng 1758 cm-1 là do phản ứng hình thành liên kết carbamate (NH2COOH) giữa CCF và mPEG-NH2.
Bảng 3.5. Kết quả phổ FT-IR của mPEG, mPEG-NPC, mPEG-NH2, CCF và mPEG-Chol
Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm
-1)
mPEG mPEG-NPC mPEG-NH2 CCF mPEG-Chol
a -CH2 2899 2900 2901 2900 b C-O-C 1120 1122 1123 1177 c -NO2 1471 d -C=O 1776 e -NHCOO- 1722 1758 f -CCOCl 1783
Qua bảng thống kê dữ liệu phổ của các chất (Bảng 3.5), có sự lặp lại các tín
hiệu dao động đặc trưng trên phân tử mPEG-NH2 ở vị trí a, b ln xuất hiện trong
phân tử mPEG-Chol sau khi tổng hợp. Sự dịch chuyển tín hiệu dao động ở vị trí f về vị trí e cho thấy sự hình thành liên kết carbamate từ phản ứng giữa CCF và mPEG- NH2.
Dữ liệu phổ FT-IR của 5 sản phẩm mPEG-Chol (mPEG550-Chol, mPEG1100-Chol, mPEG5000-Chol, mPEG10000-Chol và mPEG20000-Chol) được trình bày trong Phụ lục 2.
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của mPEG5000-Chol:
Thành phần và cấu trúc của mPEG-NPC được xác định qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz, D2O, ppm) (Phụ lục 3). Trên phổ 1H-NMR của mPEG trong mPEG-NPC xuất hiện tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 3,43
ppm là tín hiệu proton của nhóm methyl -CH3 (a, mũi đơn); ẟH = 3,63 – 3,86 ppm là tín hiệu proton methylene của nhóm -CH2-OCH2- (b, mũi đa). Đặc biệt, sự xuất
(c, mũi đa) và ẟH = 4,52 – 4,57 ppm là tín hiệu proton methylene của nhóm -CH2- O- NPC (d, mũi đa) liên kết trực tiếp với nhóm carbonate trên NPC. Sự xuất hiện của hai tín hiệu ở ẟH = 7,51 – 7,59 ppm (f, mũi đôi) và ẟH = 8,38 – 8,49 ppm (g, mũi đơi) là hai tín hiệu đặc trưng proton vịng thơm nhóm (-CH=CH-) của NPC. Từ phổ 1H-NMR ở Phụ lục 3 cho thấy đã tổng hợp thành công mPEG-NPC.
Phổ 1H-NMR của mPEG-NH2 (500 MHz, D2O, ppm) (Phụ lục 4) xuất hiện tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 3,43 ppm là tín hiệu proton của nhóm
methyl -CH3 (a, mũi đơn); ẟH = 3,63 – 3,86 ppm là tín hiệu proton methylene của nhóm -CH2-OCH2- (b, mũi đa); ẟH = 3,46 – 3,53 ppm là tín hiệu proton methylene của nhóm -CH2-NH- (i, mũi đơn). Proton methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate của NPC ở ẟH = 4,52 – 4,57 ppm (-CH2-O-NPC) (d, mũi đa) dịch chuyển về vùng ẟH = 4,24 – 4,32 ppm (-CH2-O-CO-EDA) (e, mũi đa), do phản ứng thay thế NPC bằng ethylenediamine.
tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 3,43 ppm là tín hiệu proton của nhóm
methyl -CH3 (a, mũi đơn); ẟH = 3,63 – 3,86 ppm là tín hiệu proton methylene của nhóm -CH2-OCH2- (b, mũi đa) của mPEG. Tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 1,00 ppm (m, mũi đơn); ẟH = 0,67 ppm (n, mũi đơn); ẟH = 0,83 – 0,87 ppm (p,q; mũi đa) và ẟH = 0,89 – 0,92 ppm (r, mũi đơi) là tín hiệu đặc trưng của cholesterol. Mất tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 3,46 – 3,53 ppm của nhóm -CO-NH- CH2-CH2-NH2 (i, mũi đơn) và chỉ cịn tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ẟH = 3,16
– 3,20 ppm (h, mũi đơn) chứng tỏ rằng có sự liên hợp giữa mPEG-NH2 và cholesterol.
Dữ liệu phổ 1H-NMR theo Hình 3.2 được thống kê qua Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả phổ 1H-NMR của mPEG-NPC, mPEG-NH2 và mPEG-Chol
Vị
trí H H của nhóm
Độ dịch chuyển hóa học ( , ppm)ẟ
mPEG-NPC mPEG-NH2 mPEG5000-Chol
a -CH3 3,43 3,43 3,34 b -O-CH2-CH2- 3,63 – 3,86 3,63 – 3,86 3,58 – 3,64 c -CH2-CH2O-O- 3,87 – 3,94 3,87 – 3,91 3,77 d -CH2-O-NPC 4,52 – 4,57 e -CH2-O-CO- 4,24 – 4,32 4,20 f,g -CH=CH- (vòng thơm) 7,51 – 7,59 và 8,38 – 8,49 h CH2-NH2 3,16 – 3,20 3,27 i -CH2-NH- 3,46 – 3,53 k -NH-CH2-CH2-NH- 4,47 l -C=CH-CH2 5,35 m - CH2-CH-CH- 1,00 n - CH2-CH-CH- 0,67 o -CH-CH2-C=CH- 2,33 p,q - CH2-CH-(CH3)2 0,83 – 0,87 r - CH-CH2-C=CH- 0,89 – 0,92
Qua bảng thống kê dữ liệu phổ (Bảng 3.6) cho thấy sản phẩm tổng hợp mPEG-NH2 ngoài sự lặp lại các tín hiệu proton từ mPEG-NPC ở vị trí a, b, c cịn có sự xuất hiện thêm tín hiệu mới tại vị trí i, h và mất tín hiệu ở vị trí f, g do sự thay thế NPC từ mPEG-NPC thành mPEG-NH2. Sản phẩm mPEG-Chol được tổng hợp
tại vị trí h.
Dữ liệu phổ 1H-NMR của các sản phẩm mPEG-Chol còn lại (mPEG550- Chol, mPEG1100-Chol, mPEG10000-Chol và mPEG20000-Chol) được thống kê qua Phụ lục 5, Phụ lục 6, Phụ lục 7 và Phụ lục 8. Từ kết quả phổ FT-IR và phổ 1H- NMR cho thấy đã tổng hợp thành công mPEG-Chol với 5 khối lượng phân tử (mPEG550, mPEG1100, mPEG5000, mPEG10000 và mPEG20000).
3.2.2. Kết quả biến tính bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Chol và đánh giá tính chất vật liệu
3.2.2.1. Kết quả khảo sát các yếu tố lên q trình biến tính bề mặt nanoliposome
a. Kết quả khảo sát khối lượng phân tử mPEG
Kích thước và hệ số đa phân tán của nanoliposome được biến tính bề mặt bằng mPEG-Chol (SLP@mPEG-Chol) với 5 khối lượng phân tử mPEG khác nhau được trình bày trong Bảng 3.7. Dữ liệu kết quả DLS của các sản phẩm SLP@mPEG-Chol được thể hiện trong Phụ lục 9.