CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Kết quả tổng hợp và khảo sát nanoliposome mPEG-CS
3.3.1. Kết quả tổng hợp mPEG-CS
Để tổng hợp mPEG-CS, mPEG được hoạt hóa bằng NPC tạo sản phẩm mPEG-NPC. mPEG-NPC được dùng làm tác chất cho phản ứng ghép với chitosan. Liên kết carbamate được tạo thành từ phản ứng giữa nhóm amine trong phân tử chitosan và nhóm –COO của mPEG-NPC tạo sản phẩm là mPEG-CS.
3.3.1.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR
nhóm -NO2 liên kết trực tiếp với nhân thơm trên p-nitrophenyl chloroformate xuất hiện dao động tại số sóng 1470 cm-1.
Nhóm N-H liên kết trực tiếp với nhân thơm trên chitosan xuất hiện dao động tại số sóng 1423 cm-1.
Phổ FT-IR của mPEG-CS có dao động liên kết của nhóm N-H là nhóm chức đặc trưng cho chitosan liên kết với mPEG và xuất hiện tại số sóng 1421 cm-1. Ở số sóng 1668 cm-1 là của nhóm carbonyl cịn ở số sóng 1122 cm-1 là của nhóm C-O-C. Nhóm methylen xuất hiện ở số sóng 2989 cm-1 và dao động xuất hiện ở số sóng cao nhất là của nhóm -OH ở 3489 cm-1. Kết quả phân tích FT-IR ở trên cho thấy rằng sản phẩm mPEG-CS đã được tổng hợp thành công.
Dữ liệu phổ FT-IR của mPEG, mPEG-NPC, chitosan và mPEG-CS theo
Hình 3.12 đã được thống kê qua Bảng 3.11. Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của các
chất, cho thấy tín hiệu dao động đặc trưng ở vị trí a, b ln xuất hiện trong phân tử mPEG, mPEG-NPC và mPEG-CS. Tín hiệu dao động ở vị trí c chỉ xuất hiện ở sản phẩm mPEG-NPC và tín hiệu dao động đặc trưng ở vị trí d, m xuất hiện trong phân tử mPEG-CS do sự hình thành liên kết carbamate của mPEG-CS.
Bảng 3.11. Kết quả phổ FT-IR của mPEG, mPEG-NPC, chitosan và mPEG-CS
Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm
-1)
mPEG mPEG-NPC Chitosan mPEG-CS
a -C-H 2888 2887 2898 2898 b C-O-C 1120 1121 1122 c -NO2 1470 d -C=O 1678 1668 m N-H 1423 1421 n -OH 3509 3411 3489
Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của mPEG-NPC và mPEG-CS
Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của mPEG-CS được thể hiện qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz, D2O, ppm) (Hình 3.13). Phổ 1HNMR của mPEG-CS cho thấy ẟH = 2,11 ppm và 3,01 ppm là tín hiệu proton của nhóm - NH-CO-CH3 (7, mũi đơn) và nhóm -CH-NH- (2, mũi đa) là những nhóm đặc trưng chitosan. Ở ẟH = 3,62 - 3,84 ppm (1,3,4,5,6,a,b,c) là tín hiệu proton của nhóm –
OCH3 của chitosan và của mPEG. Qua kết quả phân tích phổ 1HNMR cho thấy chitosan ghép mPEG (mPEG-CS) đã được tổng hợp thành công.
Dữ liệu phổ 1H-NMR của mPEG-NPC và mPEG-CS theo Hình 3.13 được thống kê qua Bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả 1H-NMR của mPEG-NPC và mPEG-CS
Vị trí H H của nhóm Độ dịch chuyển hóa học ( , ppm)ẟ
b -O-CH2-CH2- 3,63 – 3,86 3,68 – 3,87 c -CH2-CH2O-O- 3,87 – 3,94 3,99 d -CH2-O-NPC 4,52 – 4,57 f, g -CH=CH- (vòng thơm) 7,51 – 7,59 và 8,38 – 8,49 1,3,4,5,6,a,b,c –OCH3 3,55 – 4,01 2 -CH-NH- 3,01 7 -NH-CO-CH3 2,11
Kết quả thế hiện trong Bảng 3.12 cho thấy sản phẩm tổng hợp mPEG-CS ngồi sự lặp lại các tín hiệu proton từ mPEG-NPC ở vị trí a, b, c cịn có sự xuất hiện thêm tín hiệu mới tại vị trí 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và mất tín hiệu ở vị trí f, g do sự thay thế NPC từ mPEG-NPC thành mPEG-CS.
3.3.1.3. Kết quả khảo sát nồng độ mPEG-CS
Kết quả DLE và DLC của năm nồng độ mPEG-CS được sử dụng để tổng hợp hệ SLP@mPEG-CS được thể hiện trên Hình 3.14.
Hình 3.14. Hiệu suất mang thuốc (a) và khả năng mang thuốc (b) của hệ
tương tự với hệ liposome được biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-Chol, DLE đối với PTX của hệ SLP@mPEG-CS cao hơn so với CAR. Kết quả này có thể được giải thích bằng tính tan của thuốc dẫn đến sự khác nhau về vị trí của thuốc trong hệ nanoliposome biến tính PEG. Tương tự với biến tính bằng vật liệu mPEG-Chol, chuỗi PEG của vật liệu mPEG-CS theo tương tác tĩnh điện sẽ phủ một lớp bên ngoài lớp phospholipid của liposome. Vì vậy, đối với khoang nước bên trong liposome, chuỗi PEG ưa nước cũng sẽ chiếm một khoảng không gian dẫn đến giảm khoảng khơng chứa thuốc ưa nước mà cụ thể trong thí nghiệm này là thuốc CAR.
Kết quả cho thấy sự gia tăng nồng độ mPEG-CS dẫn đến thay đổi DLE và DLC. Khi nồng độ mPEG-CS tăng từ 2% lên 8%, DLE tăng dần từ 64,53% lên 83,79% đối với PTX và tăng từ 47,33% đến 50,88% đối với CAR. Tuy nhiên, DLE không tăng thêm mà giảm dần khi nồng độ mPEG-CS tăng lên đến 10% ở cả hai thuốc. Kết quả này cho thấy rằng nồng độ mPEG-CS có tác động đáng kể đến DLE. Hiệu quả tải thuốc của SLP@mPEG-CS cũng được phát hiện là cao nhất ở nồng độ mPEG-CS là 8%. Vì vậy, nồng độ mPEG-CS 8% được chọn cho tổng hợp hệ nanoliposome biến tính PEG bằng mPEG-CS.
Kích thước và hệ số đa phân tán của SLP@mPEG-CS ở
Phụ lục 10 được thống kê qua Bảng 3.13.
Bảng 3.13. Kết quả DLS và thế zeta của sản phẩm SLP@mPEG-CS sau tổng hợp
và sau 1 tuần bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC
SLP@mPEG-CS Cảm quan Kích thước hạt (nm) Hệ số đa phân tán (PDI) Thế zeta (mV) Sau tổng hợp Trong 167,70 ± 10,47 0,326 ± 0,029 -54,67 ± 1,56 Sau 1 tuần Trong 166,45 ± 0,49 0,452 ± 0,061 -77,60 ± 1,71
chất vật liệu
3.3.2.1. Kết quả nang hóa thuốc
SLP@mPEG-CS nang hóa PTX (PTX/SLP@mPEG-CS) và CAR (CAR/SLP@mPEG-CS) thông qua tương tác kỵ nước. Trong môi trường hydrat, nanoliposome tự lắp ráp nhờ vào tương tác kỵ nước để hình thành lớp đơi phospholipid. Sau đó, mPEG-CS được gắn vào bề mặt liposome nhờ vào lực tương tác tĩnh điện (mPEG-CS mang điện tích dương và liposome mang điện tích âm) tạo thành hệ nanoliposome được biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-CS. Trong q trình hydrat này, thuốc đồng thời cũng được mang vào hệ SLP@mPEG-CS nhờ vào tương tác kỵ nước. Trong đó, PTX sẽ nằm trong lớp đơi phospholipid và CAR sẽ nằm trong khoang nước của SLP@mPEG-CS.
a. Kết quả phân tích phổ FT-IR
Kết quả cho thấy các dao động đặc trưng của cả SLP và mPEG-CS đều xuất hiện trong phổ FT-IR của PTX/SLP@mPEG-CS và CAR/SLP@mPEG-CS: 1384 cm-1 là dao động của liên kết C-O và 2965 cm-1 là dao động liên kết C-H của chuỗi acid béo trên lecithin của SLP; ở 1421 cm-1 là của nhóm N-H nhóm chức đặc trưng của chitosan liên kết với mPEG, ở 1668 cm-1 là của nhóm carbonyl, ở 1122 cm-1 là của nhóm C-O-C, nhóm methylen xuất hiện ở số sóng 2989 cm-1 và ở 3489 cm-1 là của nhóm -OH.
1690 cm-1 là dao động của liên kết C-C và ở1278 cm-1 là dao động liên kết C- N trên phân tử PTX cho thấy xuất hiện trên PTX/SLP@mPEG-CS. Dao động của kết Pt-NH2 xuất hiện ở 1399 và 1392 cm-1 trên phân tử CAR cho thấy xuất hiện trên CAR/SLP@mPEG-CS [79].
CAR/SLP@mPEG-CS
Dữ liệu phổ FT-IR của SLP, mPEG-CS, PTX/SLP@mPEG-CS và CAR/SLP@mPEG-CS theo Hình 3.15 được thống kê qua Bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả phổ FT-IR của SLP, mPEG-CS, PTX/SLP@mPEG-CS và
CAR/SLP@mPEG-CS Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm-1) SLP mPEG -CS SLP@ mPEG -CS PTX CAR PTX/SLP @mPEG- CS CAR/SLP @mPEG- CS a -CH2 2900 2913 2922 2913 b C-O-C 1123 1121 1111 1147 d -C=O 1668 1694 1694 1694 g C-O- 1384 1303 1385 1303 1286 h C-H 2965 2987 2978 2954 Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm-1) SLP mPEG -CS SLP@ mPEG -CS PTX CAR PTX/SLP @mPEG- CS CAR/SLP @mPEG- CS
k C-N 1278 1294 l Pt-NH2 1399- 1392 1441 m N-H 1421 1478 1472 1471 n -OH 3489 3491 3490 3490
Qua bảng thống kê dữ liệu phổ của các chất (Bảng 3.14) cho thấy sự lặp lại các tín hiệu dao động đặc trưng trên phân tử mPEG-CS ở vị trí a, b, d, m, n và trên phân tử SLP ở vị trí g, h ln xuất hiện trong phân tử PTX/SLP@mPEG-CS và CAR/SLP@mPEG-CS sau khi tổng hợp. Trong phổ đồ của PTX/SLP@mPEG-CS xuất hiện các dao động ở vị trí i, k chứng tỏ đã nang hóa thành cơng PTX vào SLP@mPEG-CS. Trong khi đó, phổ đồ của CAR/SLP@mPEG-CS xuất hiện tín hiệu dao động tại vị trí l chứng tỏ đã nang hóa thành cơng CAR vào hệ SLP@mPEG-CS.
b. Kết quả TEM và DLS PTX/SLP@mPEG-CS
Hệ nanoliposome biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-CS với nồng độ 8% mang thuốc PTX cho kết quả kích thước hạt trung bình là 121,27 nm với hệ số đa phân tán là 0,277 ± 0,018 và mang điện tích âm (-49,10 ± 2,30 mV). Kết quả TEM cho thấy PTX/SLP@mPEG-CS có dạng hình cầu (Hình 3.16.c).
PTX/SLP@mPEG-CS
CAR/SLP@mPEG-CS
Kết quả cho thấy kích thước trung bình của CAR/SLP@mPEG-CS là 151,13 nm với hệ số đa phân tán là 0,361 và thế zeta là -65,8 mV. Hình TEM biểu thị sự phân bố kích thước CAR/SLP@mPEG-CS cho thấy các hạt có dạng hình cầu.
CAR/SLP@mPEG-CS
Kết quả kích thước và hệ số đa phân tán của hệ nanoliposome biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-CS mang thuốc PTX, CAR đều cho thấy kích thước hạt nhỏ hơn 200 nm và hệ số đa phân tán < 0,5. Đây đều là những thông số phù hợp cho một hệ mang thuốc tiềm năng trong điều trị ung thư.
3.3.2.2 Kết quả đánh giá độ ổn định trong huyết thanh
Kết quả khảo sát độ ổn định trong huyết thanh của hệ SLP@mPEG-CS mang thuốc cho thấy rằng độ hấp thu của PTX/SLP@mPEG-CS và CAR/SLP@mPEG- CS có sự thay đổi trong 6 giờ đầu và duy trì ổn định trong 18 giờ tiếp theo (
Hình 3. 18). Trong khi đó, độ ổn định của hệ liposome khơng biến tính
PTX/SLP và CAR/SLP cho thấy giảm độ hấp thu khi thời gian khảo sát tăng lên vì hệ đã lắng xuống dưới đáy ống nghiệm. Kết quả khảo sát cho thấy nanoliposome
huyết thanh.
Hình 3.18. Kết quả đánh giá sự thay đổi độ đục (được biểu thị bằng độ hấp thu) của
PTX/SLP@mPEG-CS (a, b) và CAR/SLP@mPEG-CS (c, d) khi ủ với 50% FBS
3.3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng phóng thích thuốc
a. Paclitaxel
Kết quả khảo sát khả năng phóng thích thuốc PTX của hệ SLP@mPEG-CS được thể hiện trong Hình 3.19.
SLP và SLP@mPEG-CS trong môi trường PBS (pH 7,4)
Kết quả cho thấy PTX ngun liệu cho tốc độ phóng thích thuốc nhanh trong 12 giờ đầu khảo sát với 66,82% PTX được phóng thích. Trong khi đó, trong cùng khoảng thời gian 12 giờ khảo sát, 31,23% PTX được phóng thích từ liposome (PTX/SLP) và 21,87% PTX được phóng thích từ hệ liposome được biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-CS (PTX/SLP@mPEG-CS). Sau 48 giờ khảo sát, 70,16% PTX được phóng thích từ PTX ngun liệu, 38,06% PTX được phóng thích từ PTX/SLP và 26,01% PTX được phóng thích từ PTX/SLP@mPEG-CS. Kết quả cho thấy cả ba hệ khảo sát đều cho thấy tốc độ phóng thích nhanh trong 12 giờ đầu và phóng thích chậm và duy trì tốc độ ổn định cho đến 48 giờ. Trong đó, hệ PTX/SLP@mPEG-CS cho khả năng phóng thích kéo dài hơn hệ nanoliposome chưa biến tính.
Mơ hình động học phóng thích thuốc:
Các tham số giải phóng động học và hệ số hồi quy được tính tốn từ bốn mơ hình động học được sử dụng để phân tích các dạng giải phóng thuốc in vitro của PTX nguyên liệu và PTX được nang hóa trong SLP và PTX được nang hóa trong SLP@mPEG-CS (bậc khơng, bậc một, Higuchi và Korsmeyer-Peppas) được trình bày trong Bảng 3.15.
nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-CS thu được thơng qua mơ hình động học bậc khơng, mơ hình động học bậc một, mơ hình Higuchi và mơ hình Korsmeyer-Peppas
Mơ hình bậc khơng Mơ hình bậc một Mơ hình Higuchi Mơ hình Korsmeyer- Peppas k0 R2 kf R2 kH R2 kK n R2 PTX 0,6757 0,5538 0,0030 0,5202 3,8331 0,6408 33,312 0,1750 0,7816 PTX/ SLP 0,4886 0,7393 0,0029 0,7787 2,4678 0,6898 13,219 0,3045 0,9023 PTX/ SLP@ mPEG -CS 0,1178 0,6230 0,0006 0,6341 1,2381 0,7962 9,587 0,1761 0,9153
và PTX/SLP@mPEG-CS thông qua bốn mơ hình động học: (a) Mơ hình bậc khơng, (b) Mơ hình bậc một, (c) Mơ hình Higuchi và (d) Mơ hình Korsmeyer-Peppas
Đối với mỗi mơ hình động học tương ứng, dạng phóng thích của PTX được nang hóa trong cả hai hệ nanoliposome và nanoliposome biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-CS đều cho thấy mối tương quan cao nhất với mơ hình Korsmeyer- Peppas (R2 = 0,9023 đối với PTX/SLP và R2 = 0,9153 đối với PTX/SLP@mPEG- CS). Theo mơ hình Korsmeyer-Peppas, với giá trị n < 0,45, cả hai hệ SLP và SLP@mPEG-CS đều cho cơ chế phóng thích thuốc tn theo khuếch tán Fickian (n = 0,3045 đối với PTX/SLP và n = 0,1761 đối với PTX/SLP@mPEG-CS) [66]. Điều này có nghĩa là tốc độ phóng thích của thuốc PTX tỷ lệ với nồng độ thuốc PTX có trong hệ. Cũng trong mơ hình này, hằng số kk cho thấy xu hướng khi nang hóa thuốc vào SLP và SLP@mPEG-CS (kk = 33,312 đối với PTX; kk = 13,219 đối với PTX/SLP và kk = 9,587 đối với PTX/SLP@mPEG-CS). Kết quả này cho thấy tác động của hệ liposome đối với q trình phóng thích thuốc. Trong đó, việc biến tính bề mặt liposome bằng mPEG-CS cho thấy việc kéo dài phóng thích thc PTX (kk của PTX/SLP nhỏ hơn kk của PTX/SLP@mPEG-CS).
b. Carboplatin
Hình 3.21. Kết quả phóng thích thuốc CAR ngun liệu, CAR được nang hóa trong
CAR/SLP và CAR/SLP@mPEG-CS cho thấy hệ CAR/SLP@mPEG-CS phóng thích thuốc chậm hơn và phần trăm CAR được phóng thích thấp hơn so với CAR ngun liệu và CAR/SLP sau 48 giờ (Hình 3.21). Sau 48 giờ, 98,14% CAR được phóng thích từ CAR ngun liệu, 71,22% CAR được phóng thích từ hệ CAR/SLP và 51,02% CAR được phóng thích từ CAR/SLP@mPEG-CS. Kết quả đánh giá khả năng phóng thích thuốc của nanoliposome và nanoliposome biến tính mPEG-Chol cho thấy cả hai hệ đều cho thấy cơ chế phóng thích giống nhau. Sự phóng thích hồn tồn của thuốc CAR ngun liệu xảy ra trong 48 giờ; trong khi thuốc được phóng thích từ hệ liposome và liposome được biến tính cho thấy phóng thích nhanh vào giai đoạn đầu, phóng thích chậm và khơng đổi vào giai đoạn hai. Kết quả trên cho thấy rằng việc thủy phân cấu trúc cao phân tử của hệ nanoliposome chưa biến tính và biến tính bằng vật liệu mPEG-Chol cần thời gian lâu hơn. Vì vậy, sự phóng thích thuốc sau 48 giờ khảo sát của cả hai hệ nanoliposome đều cho thấy sự phóng thích thuốc CAR chậm. Trong đó, hệ SLP@mPEG-CS cho thấy sự phóng thich CAR được kéo dài hơn so với SLP.
Mơ hình động học phóng thích thuốc:
Bảng 3.16. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của CAR, CAR/SLP và
CAR/SLP@mPEG-CS thu được thông qua mơ hình động học bậc khơng, mơ hình động học bậc một, mơ hình Higuchi và mơ hình Korsmeyer-Peppas
Mơ hình bậc khơng Mơ hình bậc một Mơ hình Higuchi Mơ hình Korsmeyer- Peppas k0 R2 kf R2 kH R2 kK n R2 CAR 0,5095 0,8037 0,0232 0,9767 8,2091 0,4366 71,400 0,0839 0,9873 CAR /SLP 0,4684 0,6677 0,0053 0,7515 4,1583 0,3450 46,462 0,1214 0,9107 CAR /SLP@ mPEG 0,3607 0,6721 0,0027 0,7075 2,5845 0,3742 32,151 0,1318 0,9339
Các tham số giải phóng động học và hệ số hồi quy được tính tốn từ bốn mơ hình động học phóng thích thuốc của của CAR, CAR nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-CS được trình bày trong Bảng 3.16. Kết quả cho thấy CAR nguyên liệu cho giá trị R2 theo thứ tự giảm dần là 0,9873, 0,9767, 0,8037 và 0,4366 đối với các mơ hình lần lượt là mơ hình Korsmeyer-Peppas, mơ hình bậc một, mơ hình bậc