3.2.3.1 Phương pháp vi sinh
a. Đếm khuẩn lạc
Cho phép xác định số tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di
được tính theo công thức sau:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V
Trong đó Ai là số khuẩn lạc trung bình trong 1 đĩa, Dilà độ pha loãng và V là dung dịch huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (0.1ml).
Phương pháp tiến hành.
b. Đếm bằng buồng đếm hồng cầu
Nguyên lý: kích thước tế bào nấm men và vi khuẩn là tương đối lớn nên có thể định lượng số tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
Nguyên tắc: Buồng đếm là những lam kính có khắc rãnh, phân thành mạng
lưới, các ô vuông cực nhỏcó kích thước xác định. Trên mỗi ô vuông giữa lam kính và lame là một thểtích xác định, tuy nhỏ nhưng rất chính xác. Đếm số tế bào trên các ô
Mẫu chứa nấm men
Saccharomyces cerevisiae
Pha loãng mẫu theo dãy thập phân
Ủở 320C 1-2 ngày
Đếm khuẩn lạc trên mỗi đĩa
Đổ 0.1ml mẫu đã pha loãng vào đĩa
dưới kính hiển vi và nhân với thể tích tương ứng có thể quy ra số tế bào vi sinh vật trong một ml mẫu.
Tiến hành
Nếu chồi lớn hơn 1/2 tế bào mẹ thì đếm 2 tế bào. Nếu chồi nhỏhơn 1/2 tế bào mẹ thì đếm 1 tế bào.
Nếu các tế bào vi sinh vật nằm trên cạnh của ô đếm: số lượng tế bào trong 1 ô
đếm bằng số tế bào trong ô đó cộng thêm số tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp của ô
đếm. Kết quả: 4000 1000 ax xb X x c
Với X: lượng tế bào trong 1ml
a: sốlượng tế bào trong 5 ô lớn
b: tỷ lệ pha loãng canh trường (nghịch đảo nồng độ pha loãng) c: số ô nhỏ trong 5 ô lớn (c = 16 x 5 = 80).
Nước Mẫu
Nhỏ lên hai khoang
Pha loãng Đậy lá kính (dùng tay ấn nhẹ) Thấm nước dư Nhỏ lên cạnh buồng đếm Quan sát qua kính Đếm số tế bào trên 5 ô lớn Nước
3.2.3.2 Phương pháp hóa sinh a. Đo OD
Mật độ vi sinh vật có thể được xác định một cách gián tiếp thông qua đo độ đục. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm
môi trường trởnên đục. Độđục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Do vậy, có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độđục bằng máy so màu ở bước sóng 600 - 610nm. Trong trường hợp này, trước tiên cần phải thiếp lập được
đường quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách sử dụng một số
huyền phù tế bào có độ đục xác định và mật độ tế bào của mỗi huyền phù được xác
định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
b. Đo độ rượu
Tiến hành chưng cất hỗn hợp gồm 30ml rượu cần cất và 30 ml nước cho tới khi bình đựng hỗn hợp rượu và nước chỉ còn 30ml thì dừng. Ta tiến hành xác định độrượu bằng phương pháp bình tỷ trọng.
Dựa vào bảng tra nồng độ ethanol nguyên chất theo tỷ trọng, suy ra hàm lượng ethanol trong mẫu chưng cất.
c. HPLC
Đểxác định hàm lượng acid malic và acid lactic ta dùng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Các mẫu được phân tích tại phòng thí nghiệm chuyên hóa sinh học và trung tâm phân tích thí nghiệm TP.HCM.
3.2.3.3 Hóa lý a. pH
Sử dụng máy đo pH để xác định độ pH của mẫu. Sau khi dùng các dung dịch
đệm để chỉnh máy, ta cắm diện cực của máy đo vào dung dịch cần đo và đợi đến khi máy ổn định thì đọc giá trị pH trên máy. Mỗi lần đo chúng tôi đều lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình.
b. Brix
Sử dụng khúc xạ kế cầm tay, đơn vị đo là oBx đểxác định hàm lượng chất khô có trong dung dịch. Lau khô mặt kính của khúc xạ kế, khuấy đều dung dịch cần đo và
lấy 1 giọt nhỏ lên mặt kính (tránh để bọt khí), quan sát rồi đọc kết quả. Lặp lại 3 lần để
3.2.3.4 Khác
* Cảm quan
Phương pháp phân tích cảm quan.
Chất lượng cảm quan sản phẩm được đánh giá bằng phương pháp so sánh cặp theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 3215 – 79).
Đối với sản phẩm đồ uống có cồn nói chung và sản phẩm đồ uống có cồn lên men thì các chỉ tiêu cảm quan quan trọng cần đánh giá gồm: độ trong và màu sắc, mùi, vị.
Bảng chuẩn được xây dựng để tiến hành đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm rượu chanh dây được ghi chú trong phần phụ lục.
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Kiểm tra đặc điểm giống vi sinh vật:
4.1.1 Saccharomyces cerevisiae
4.1.1.1 Đặc điểm hình thái
Quan sát đại thể các khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae được nuôi cấy trên
môi trường thạch đĩa ta thấy các khuẩn lạc có dạng hình tròn, mọc lồi và có màu trắng,
đường kính khuẩn lạc tương đối lớn, từ 2 – 3 mm.
Hình 4. 1 Hình ảnh đại thểSaccharomyces cerevisiae trên môi trường đặc Quan sát vi thể: nhuộm đơn và quan sát hình thái của tế bào nấm men dưới kính hiển vi ở vật kính 40 ta thấy tế bào nấm men có hình oval, to.
4.1.1.2 Đư
Nhân giống cấp 1: S nghiêng cấy sang ống nghi cấy trong 1 ngày.
Nhân giống cấp 2: chuy
100ml môi trường Hansen l ta sẽ vẽđược đường cong sinh trư
Đồ thị 4. 1Đường cong sinh trư
4.1.1.3 Đườ
Nấm men Saccharomyces cerevisiae
pha loãng ở các nồng độ định lượng trực tiếp bằng bu Bảng 4. 1 Mẫu 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 6 7 0 12
Đường cong sinh trưởng
p 1: Sử dụng que cấy vòng lấy một vòng sinh kh ng nghiệm có chứa 5ml môi trường Hansen l
p 2: chuyển toàn bộ ống giống cấp 1 sang bình erlen có ch ng Hansen lỏng, nuôi cấy và lấy mẫu theo giờ đểđo OD, t
ng cong sinh trưởng của nấm men.
ng cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae
ờng chuẩn
Saccharomyces cerevisiae sau khi được nhân gi khác nhau rồi đem đi đo độđục (OD) ởbư
ng buồng đếm hồng cầu. Kết quảthu được ở
1 Kết quả lập đường chuẩn Saccharomyces cerevisiae
OD MĐTB Logx 1.104 826 7.560 0.901 711 7.551 0.796 495 7.393 0.514 354 7.248 0.350 300 7.176 24 36 48 60 72 t vòng sinh khối từ ống thạch ng Hansen lỏng, ủ ở 30oC, nuôi p 1 sang bình erlen có chứa
đo OD, từ số liệu này
Saccharomyces cerevisiae c nhân giống cấp 2 sẽ được bước sóng 600 nm và ở bảng sau Saccharomyces cerevisiae Logx 560 551 393 248 176 84 96
Đồ thị 4. 2 Đường chuẩn của nấm men Saccharomyces cerevisiae
4.1.2 Oenococcus oeni
4.1.1.1 Đặc điểm hình thái
Nhuộm Gram và quan sát tế bào vi khuần Oenococcus oenidưới kính hiển vi ta thấy các tế bào có dạng hình trứng dài, kích thước khoảng 0.5 – 0.7 µm. Tuy nhiên kích thước và hình dạng của tếbào thay đổi tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy. Các tế
bào vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ hoặc kết thành chùm 2, 3 tế bào hoặc kết thành chuỗi, các tếbào đều là vi khuẩn Gram dương, không chuyển động, không sinh bào tử.
Hình 4. 3: Hình ảnh vi thểOenococcus oenidưới kính hiển vi
y = 0.672x + 6.892 R² = 0.968 7.10 7.20 7.30 7.40 7.50 7.60 7.70 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
4.1.1.2 Đư
Cách thực hiện tương t nhưng đo OD ởbước sóng 610
Sau khi lấy mẫu và đo OD chúng tôi xây d như sau: Đồ thị 4. 3 Đườ 4.1.1.3 Đườ Đồ thị 4. 4 .0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 0 20 O D 6.90 7.0 7.10 7.20 7.30 7.40 7.50 7.60 7.70 0 0.2
4.1.1.2 Đường cong sinh trưởng
n tương tự như khi lập đường cong sinh trư
c sóng 610 nm.
u và đo OD chúng tôi xây dựng được đườ
ờng cong sinh trưởng của vi khuẩn Oenococcus oeni
ờng chuẩn
4 Đường chuẩn của vi khuẩn Oenococcus oeni
40 60 80 100
y = 0.419x + 6.892 R² = 0.992
0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
OD
sinh trưởng của nấm men,
ờng cong sinh trưởng
Oenococcus oeni
Oenococcus oeni
120 140
4.1.3 Acetobacter xylinum
Quan sát đại thể các khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa chúng tôi thấy rằng các khuẩn lạc Acetobacter xylinum màu trắng, kích thước tương đối nhỏ (đường kính khoảng 1mm). Nhưng khi nuôi cấy trên môi trường lỏng ở chế độ tĩnh thì vi khuẩn
Acetobacter xylinum mọc thành một lớp váng nổi lên trên bề mặt của môi trường. Đây
cũng là một đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter xylinum giúp ta có thểứng dụng nó để
làm chất mang.
Hình 4. 4 Hình thái khuẩn lạc Acetobacter xylinum trên thạch đĩa và lớp váng vi khuẩn
Acetobacter xylinumtrên môi trường lỏng.
4.2 Lên men tạo BC
4.2.1 Lên men thu nhận BC
Sau khi lên men bằng môi trường MT5 trong khay nhựa, sau 7 – 10 ngày thì chúng
tôi thu được BC tươi là một tấm dai, chắc, có kích thước là 30 x 20 cm, dày khoảng 1 cm, sậm màu (hình 4.6).
Hình 4. 6 BC tươi sau khi lên men
4.2.2 Xử lý chế phẩm BC thô
Do BC tươi còn chứa nhiều tế bào vi khuẩn và môi trường lên men do đó chúng
tôi tiến hành xử lý BC theo mục (3.2.2.3b) sau đó ép cho sạch nước bên trong BC và cắt BC thành các miếng có kích thước khác nhau là 2 x 1, 2 x 2, 2 x 3 (cm). Có thể
nhận thấy rằng BC sau khi xửlý đã có màu trắng sáng hơn, mỏng hơn, khoảng 3 – 5 mm. BC sau khi xửlý được cho vào các erlen, tiến hành giai đoạn hấp khử trùng trong
autoclave để loại bỏ các tế bào vi khuẩn còn sót trong BC nhằm đảm bảo cho quá trình cốđịnh vi khuẩn ởgiai đoạn sau.
4.3 Khảo sát quá trình lên men malolactic bằng chủng Oenococcus oeni tự do 4.3.1 Khảo sát tỉ lệ giống Oenococcus oeni thích hợp để lên men malolactic 4.3.1 Khảo sát tỉ lệ giống Oenococcus oeni thích hợp để lên men malolactic
Dịch chanh dây sau khi kết thúc 7 ngày lên men rượu được bổ sung vi khuẩn
Oenococcus oeni với các tỉ lệ khác nhau (5%, 7%, 10%) để tiến hành lên men malolactic.
Bảng 4. 2 Sựthay đổi các yếu tố sau quá trình lên men malolactic ứng với các tỉ lệ giống khác nhau Tỉ lệ giống Yếu tố 5% 7% 10% pH 3.93 3.92 3.9 Brix 7 6.9 7 Độ acid tổng (VNaOH 0.01N (ml)) 1.45 1.5 1.55 Độ rượu 10.51 11.26 9.81 Acid lactic (g/l) 3.65 3.68 3.69 Acid malic (g/l) 1.58 1.55 1.54
Đồ thị 4. 5 Sựthay đổi pH sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau
Ta thấy mặc dù bổ sung vi khuẩn với các tỉ lệ khác nhau nhưng pH sau quá
trình lên men malolactic gần như không thay đổi, dao dộng trong khoảng từ 3.9 đến 3.93. Điều này chứng tỏ giữa các tỉ lệ giống vi khuẩn khác nhau gần như không ảnh
hưởng đến pH của dịch sau quá trình lên men malolactic. Vì vậy, để xác định tỉ lệ
giống vi khuẩn thích hợp cho quá trình lên men malolactic ta cần xem xét đến các yếu tố khác. 3.60 3.70 3.80 3.90 4.0 4.10 5% 7% 10% p H Tỉ lệ giống pH
Đồ thị 4. 6 Sựthay đổi nồng độ chất khô sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau.
Theo đồ thị ta thấy, nồng độ chất khô của dịch sau lên men thay đổi không đáng
kểứng với các tỉ lệ giống khác nhau, dao động từ 6.9 đến 7.0.
Đồ thị 4. 7 Sựthay đổi nồng độ acid tổng sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau
Theo đồ thị ta thấy, nồng độ acid tổng của dịch sau lên men mặc dù có sự thay
đổi nhưng không đáng kể ứng với các tỉ lệ giống khác nhau, dao động từ 1.45 đến 1.55. Điều này cũng phù hợp khi pH của dịch sau lên men cũng không khác nhau
nhiều. 6.0 6.20 6.40 6.60 6.80 7.0 7.20 5% 7% 10% B rix Tỉ lệ giống Độ Brix 1.0 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 5% 7% 10% VN aO H Tỉ lệ giống Độ acid tổng
Đồ thị 4. 8 Sựthay đổi độ rượu sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ
giống khác nhau
Sau quá trình lên men rượu, một lượng nhỏ nấm men còn sót lại trong dịch vẫn tiếp tục chuyển hóa đường thành rượu làm độ rượu tăng nhẹ. Tuy nhiên, khi bổ sung một lượng lớn vi khuẩn (khoảng 10%) thì vi khuẩn đã ức chế hoạt động của nấm men,
do đó độ rượu không tăng. Dựa vào đồ thị ta có thể kết luận sơ bộ tỉ lệ giống vi khuẩn thích hợp cho quá trình lên men malolactic từ5% đến 7%.
Đồ thị 4. 9 Sựthay đổi nồng độ acid malic và acid lactic sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau. 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 5% 7% 10% Độ r ư ợu Tỉ lệ giống Độ rượu 0.00 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 2.40 2.80 3.20 3.60 4.00 5% 7% 10% Acid lactic Acid malic g/ l
So sánh hai mẫu có tỉ lệ giống 5% và 7%, ta thấy lượng acid malic chuyển hóa thành acid lactic ở mẫu 7% cao hơn so với mẫu 5%, tương ứng với hàm lượng acid malic còn lại ở mẫu 7% là 1.55 và mẫu 5% là 1.58.
Như vậy, khi bổ sung Oenococcus oeni với các tỉ lệ giống khác nhau thì không làm ảnh hưởng nhiều đến quá trình lên men malolactic. Tuy nhiên dựa vào sự khác nhau về độ rượu, acid malic, acid lactic ta có thể chọn tỉ lệ giống Oenococcus oeni thích hợp nhất để bổ sung cho quá trình lên men malolactic là 7%.
4.3.2 Khảo sát thời điểm thích hợp để bổ sung giống Oenococcus oeni trong
lên men malolactic.
Chanh dây sau khi lọc lấy dịch sẽ được pha loãng và điều chỉnh sao cho hàm
lượng chất khô (độ Brix) là 20, pH = 4. Sau đó bổ sung nấm men Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Oenococcus oeni tại các thời điểm khác nhau để tiến hành lên men. Nồng độ nấm men và vi khuẩn bổ sung là 7%.
Các mẫu được bốtrí như phần 3.2.2.2b. Kết quảthu được như sau:
Bảng 4. 3 Sự biến đổi pH khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic.
Mẫu
Ngày M0 M3 M5 M6 M7
7 ngày 3.73 3.76 3.74 3.77 3.76
10 ngày 3.9 3.9 3.89 3.92 3.89
11ngày 3.88 3.91 3.91 3.92 4
Chú thích: M0: Bổsung đồng thời nấm men và vi khuẩn Oenococcus oeni.
M3: Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 3 của quá trình lên
men rượu (thời điểm nấm men đang phát triển ở pha log).
M5: Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 5 của quá trình lên
men rượu.
M6: Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 6 của quá trình lên
men rượu.
M7: Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 7, sau khi kết thúc quá trình lên men rượu.
Đồ thị 4. 10 Sựthay đổi pH trước và sau quá trình lên men malolactic
Dựa vào bảng 4.3 và đồ thị 4.10, ta thấy sau quá trình lên men malolactic, pH
tăng nhẹ từ 3.73 đến 4. Đối với các mẫu rượu lên men 11 ngày (bao gồm lên men rượu
7 ngày và lên men malolactic 4 ngày), pH tăng nhẹ từ3.88 đến 4, trong đó mẫu M7 có pH cao nhất là 4. Điều này được giải thích là do trong quá trình lên men rượu, nấm
men sinh trưởng và phát triển tạo ra sản phẩm chính là ethanol, CO2 và các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi như acid acetic, andehyt…Tuy nhiên khi kết thúc quá trình lên men
rượu, lượng CO2, ethanol và các hợp chất hữu cơ tạo ra không đáng kể. Đồng thời nhờ
hoạt động của vi khuẩn Oenococcus oeni trong quá trình lên men malolactic tiếp sau
đó để chuyển hóa acid malic (di-acid) thành acid lactic (mono-acid) nên pH môi
trường tăng nhẹ.
Bảng 4. 4 Sựthay đổi nồng độ chất khô khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác
nhau trước và sau quá trình lên men malolactic.