Các nhà nghiên cứu cho rằng các chất xúc tác sinh học được cố định là các enzyme, tế bào hoặc tổ hợp giữa chúng ở một trạng thái mà cho phép sử dụng lại hoặc liên tục .
Hình 2. 15 Các phương pháp cốđịnh vi sinh vật [9].
2.4.4.1 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang
a. Phương pháp liên kết cộng hóa trị
Đây là phương pháp liên kết tế bào với các polymer đã được hoạt hóa. Bản chất liên kết cộng hóa trị là nối tế bào vi sinh vật với chất mang thông qua cầu nối nào đó.
Cầu nối này phải có kích thước không lớn lắm và có hai đầu, một đầu nối polymer còn
đầu kia nối với tế bào.
Các chất mang thường dùng: polypeptid, polysaccharide, dẫn xuất cellulose, dextrin, các polymer tổng hợp… Có 2 cách thực hiện:
- Chất mang có khả năng liên kết trực tiếp tế bào .Việc gắn sẽ hiệu quả hơn nếu
điện tích của tế bào và của chất mang trái dấu nhau.
- Kết hợp đồng hóa trị các phân tử tế bào riêng biệt lại thành một đại phân tử
không hòa tan. Người ta thường sử dụng aldehit glutaric để làm chất gắn liên kết.
b. Phương pháp hấp phụ
Đây được coi là phương pháp tiêu biểu đầu tiên về cố định tế bào vi sinh vật. Hatori và Furusaka là những nhà khoa học đầu tiên đi tiên phong trong phương pháp
cố định vi sinh vật bằng phương pháp này. Trong quá trình cố định vi sinh vật bằng
phương pháp hấp phụ có các liên kết sau được hình thành:
- Liên kết tĩnh điện Van der walls: giữa tế bào và bề mặt chất mang tạo nên một sự
chênh lệch điện thế giúp tế bào và chất mang gắn với nhau.
- Lực mao quản: chất mang có các mao quản, khi được ngâm trong các huyền phù vi sinh vật sẽ hình thành các lực mao quản kéo huyền phù vi sinh vật vào trong lòng chất mang.
- Lực ion: tế bào vi sinh vật và chất mang gắn với nhau do bề mặt mang các ion trái dấu.
Phương pháp tiến hành:
- Phương pháp cổ điển: ngăn chất mang vào huyền phù vi sinh vật, vi sinh vật sẽ
tựđộng kết lắng và liên kết với chất mang bằng cách hấp phụ lên chất mang đó.
- Phương pháp bán cổđiển: sử dụng thêm cánh khuấy nhằm mục đích phân bố đều vi sinh vật và chất mang trong dung dịch để tăng thêm diện tích tiếp xúc giữa chất mang và vi sinh vật, vì vậy hiệu suất được cải thiện đáng kể.
- Phương pháp bơm canh trường qua cột chứa chất mang: phương pháp này cần có dòng hồi lưu vi sinh vật để nâng cao hiệu suất gắn tế bào vi sinh vật.
Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong lòng chất mang
Đối với tế bào vi sinh vật, trong một số trường hợp không nhất thiết phải gắn chặt tế bào vào bề mặt chất mang polymer mà có thể giữ nó bên trong polymer do polymer tạo mang lưới nhốt tế bào. Mạng lưới này có lỗ nhỏ tới mức không cho tế bào chui ra khỏi mạng, nhưng vẫn đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra có thể ra vào dễ
dàng.
Hình 2. 17 Cốđịnh tế bào trong lòng chất mang [9].
a. Nhốt trong các gel
Gel có thể là các polymer tổng hợp hay alginate, carrageenan. Phương pháp
nhốt trong gel là phương pháp dựa trên cơ sở tạo màng bọc hay polymer.
Nguyên tắc thực hiện: tế bào được trộn vào trong một polymer. Sau đó tiến hành trùng hợp với sự có mặt của các tác nhân khâu mạch.
b. Nhốt trong các sợi nhỏ của sợi tổng hợp
Ta cho dòng chảy tuần hoàn bên trong sợi do đó hạn chếđược sự phân cực bề
mặt và sự bịt lắp thông thường gặp với các màng. Phương pháp này thường tốt hơn phương pháp nhốt trong gel. Các sợi được dùng là các sợi nhân tạo, các sợi này
thường có độ bền acid, kiềm, các loại ion, và các dung môi hữu cơ hòa tan. Tính chất trên phụ thuộc vào bản chất hóa học của các polymer tạo ra loại sợi này.
Phương pháp này đơn giản, không đòi hỏi cải biến hóa học với chất mang polymer sợi. Polymer tạo sợi sử dụng trong cố định tế bào thường có giá rẻ và phổ
biến với sốlượng đáng kể.
Cách tiến hành: người ta bổ sung vào dung dịch có polymer tạo sợi trong dung môi hữu cơ không phân cực hoặc dung dịch huyền phù chứa đối tượng sinh học cần cố định và sau đó nhũ hóa hỗn hợp bằng cách khuấy.
Điều chỉnh nồng độ polymer đến giá trị tạo được sợi và sau đó ép chúng qua
thiết bị ép đùn vào bể lắng chứa dung môi hữu cơ trộn lẫn với dung môi của polymer tạo sợi.
Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật không cần chất mang a. Phương pháp liên kết chéo giữa các tế bào
Đây là phương pháp không sử dụng chất mang mà sẽ liên kết các protein của tế
bào cũng như các nhóm chức năng với nhau để tạo thành một cụm tế bào không hòa tan. Các tế bào sẽ được polymer hóa bằng các liên kết ngang cùng với các tác nhân liên kết như: bezidin dithiocyanat, bifuntional alkylating và glutaraladehyde.
Ởphương pháp này ta thấy có sự nhả hấp phụ các liên kết ra.
Hình 2. 18 Liên kết giữa các tế bào [9].
b. Phương pháp cố định bằng màng membrane
Hình 2. 19 Cốđịnh tế bào bằng màng membrane [9].
Các vỏ bán thấm cellulose có kích thước 10 – 12 µm đường kính và bề dày
được hình thành. Mỗi vỏ nhỏ có chứa vi sinh vật bên trong. Các vỏnày được tạo ra từ
các màng hay nguyên liệu polymer. Các màng này có vai trò thẩm thấu cho các cơ
ra ngoài do phân tử quá lớn. Hoạt động của vi sinh vật diễn ra trong màng hạt bao
màng bán thấm vì vậy phương pháp này có giới hạn là các cơ chất lớn như protein, polysaccharide không thể cho phép đi vào bên trong màng và lúc đó enzyme không
thể thực hiện phản ứng thủy phân.
Có nhiều cách gói vi sinh vật trong màng bán thấm.
Cho một dung dịch lỏng và một monomer ưa nước trong một dung môi hữu cơ
không hòa lẫn trong nước để tạo nhũ tương, sau đó thêm một monomer kỵ nước để
gây phản ứng trùng hợp tạo màng bao quanh những giọt cầu nhỏ, thường phải thêm vào một tác nhân hoạt động bề mặt để làm bền nhũ tương cũng như điều khiển kích
thước.
Một phương pháp khác: sử dụng màng siêu lọc. Phương pháp này thì tế bào tự
do trong dung dịch, màng lọc có vai trò tách sản phẩm và cơ chất. Cơ chất được tiếp tục đưa vào hệ thồng còn sản phẩm được lấy ra khỏi màng lọc. Phương pháp này cho phép áp dụng trong trường hợp cơ chất lớn hoặc cơ chất không tan. Trong quá trình đó cơ chất và tếbào được giữ lại cùng một bên màng lọc. Kết quả này còn tùy thuộc vào chất lượng màng lọc.
2.4.4.2 Một số phương pháp khác
a. Phương pháp cố định trong quá trình lạnh sâu
Sự cố định trong quá trình lạnh sâu cho phép tạo được hệ sợi có hoạt tính sinh học cao. Đặc điểm quan trọng của gel lạnh sâu là có nhiều cấu trúc lỗ to. Ngoài ra kích
thước và hình dạng của chúng có thểđiều chỉnh được bằng cách thay đổi chế độ làm việc của quá trình tạo cấy trúc lạnh sâu hoặc thay đổi nồng độ của các chất tạo gel trong dung dịch ban đầu. Vì các gel lạnh sâu có độ lỗ cao nên chúng là vật liệu rất có triển vọng làm chất mang các tế bào vi sinh vật cốđịnh.
Người ta tạo ra các gel lạnh sâu bằng cách trộn lẫn các thành phần tạo gel cần thiết và cho lạnh đến một nhiệt độâm nào đó. Sau đó khi dịch lỏng chuyển sang trạng thái rắn, thì nó được giữ ở trạng thái này trong thời gian nhất định sau đó mới làm tan nó. Khi chất tạo gel là polymer tự tạo gel (như gelatin, agar, rượu polyvinyl …) thì dịch ban đầu của polymer đó phải ở nồng độ thấp hơn nồng độngưỡng tạo gel ở nhiệt
độ trên 0oC. Chất tạo gel lạnh sâu phổ biến hơn cả để cố định tế bào vi sinh vật (vi khuẩn hoặc bào tử nấm) là rượu polyvinyl.
b. Cố định liên hợp
Mặc dù kĩ thuật cố định tế bào vi sinh vật đang phát triển, nhưng người ta vẫn còn thận trong trong việc tạo hỗn hợp tế bào trong cùng một pha cố định để lên men. Ví dụ trong lên men cồn người ta đã hỗn hợp Sacchromyces diastaticus,
Schwanniomyces castellii và Endomycopsis fibuligera. Reilly và Scott đã làm một vài thử nghiệm với việc lên men hỗn hợp cốđịnh để có được các kết quả khác nhau. Hay việc kết hợp nuôi tạo và vi sinh vật hiếu khí bằng cách bẫy trong vỏ capsule để giải quyết vấn đề oxi, như Wikstrom đã liên kết Chlorella vulgaris với Providencia sp
trong agarose để lên men tạo ketoisocaproic acid từ L – leucine.
c. Quá trình cố định nhờ photopolymer (quang polymer)
Đây là phương pháp cố định có triển vọng dựa vào photopolymer là urethane. Photopolymer là oligomer mà phân tử của nó chứa các nhóm chức năng có khả năng
tham gia vào làm dài hoặc khâu mạch để tạo thành polymer có trọng lượng phân tử cao. Các gel được khâu nối nhờ ánh sáng như trên thông thường được tạo thành bằng cách chiếu sáng cận tử ngoại theo từng đợt ngắn lên hỗn hợp dịch lỏng photopolymer có chứa các chức nhạy cảm với ánh sáng và với sự có mặt của các chất mang và dịch huyền phù chứa tế bào vi sinh vật. Còn gel polyurethande đuợc tạo thành bằng cách trộn photopolymer của urethande tan trong nước với dịch huyền phù chứa vi sinh vật. Người ta thường sử dụng pholypolymer là các chất: dimethylacrylate polyethyleneglycol (PEGM), ENTP là sản phẩm của oxyethylacrylate, isophorodi iso cyanate, polypropyleneglycol.
Bảng 2. 12 Bảng so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cốđịnh tế bào thông dụng
Stt Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm
1 Hấp phụ lên bề mặt rắn - Quá trình thực hiện đơn giản nhất. - Điều kiện nhẹ nhàng nên đảm bảo khả năng sống tế bào. - Tế bào dễ bị tách khỏi chất mang do tác động cơ học hoặc khi thay đổi điều kiện
môi trường. - Số lượng tế bào cố định được thường thấp. - Quá trình cố định “thụ động” khó điều khiển. 2 Liên kết cộng hóa trị với chất mang.
- Khảnăng trao đổi chất cao. - Độ bền liên kết giữa tế bào và chất mang tốt. - Thường ảnh hưởng đến sự sống và hoạt tính của tế bào. - Mỗi tế bào phải có phản ứng đặc thù. 3 Liên kết giữa các tế bào. - Điều kiện nhẹ nhàng, có khả năng kéo dài thời gian hoạt
động của tế bào. - Độ bền cơ học kém nhất. 4 Bao tế bào bằng màng chắn - Mật độ tế bào cốđịnh lớn. - Khảnăng trao đổi chất tốt. - Độ bền cơ học kém.
- Sựsinh trưởng của tế bào dễ
phá hủy màng chắn. Bọc tế bào trong hệ thống lỗ xốp - Mật độ tế bào lớn. - Độ bền cơ học cao. - Ứng dụng cho nhiều loại tế bào khác nhau. - Cản trở sự trao đổi chất của tế bào. - Có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của tế bào. [13][18]
Bảng 2. 13 So sánh một số tính chất của việc lên men sử dụng nấm men cố định trên gel alginate và nấm men cố định trên BC
Các tính chất BC Gel Alginate
1. Phương pháp cố định Hấp phụ lên bề mặt.
Nhốt trong lòng cấu trúc lỗ xốp của BC.
Nhốt tế bào trong cấu trúc dạng gel.
2. Tính chất cơ lý, độ cứng
Chịu lực cao. Mềm, dễ vỡ dưới tác dụng khuấy đảo.
3. Khả năng phù hợp với hình dạng thiết bị
Dạng hạt, dạng màng với kích thước mong muốn.
Dạng hạt, dạng màng.
4. Tác động kìm hãm tế bào cố định
Bảo vệ tế bào. Chưa thấy có tác động
kìm hãm. 5. Độ bền chất mang qua
các lần tái sử dụng
Sau khi hết tái sử dụng tế
bào cố định, vẫn có khả
năng tái sử dụng chất mang (khả năng này hoàn toàn không có ở những chất mang khác).
Đặc điểm này không có, dễ bị yếu tố ngoài tác
động.
6. Khả năng tái sử dụng Số lần tái sử dụng khá cao: 8 lần.
4 – 5 lần
7. Tính kinh tế của chất
mang
Rẻ Đắt
8. Tính an toàn sinh học An toàn An toàn
[1]