Cảm quan Chanh dây Saccharomyces cerevisiae Acetobacter xylinum Oenococcus oeni Lọc Khảo sát giống, sự sinh trưởng, phát triển Nhân giống cấp 1
Nhân giống cấp 2 Nhân giống cấp 2 Nhân giống cấp 1 Khảo sát giống, sự sinh trưởng, phát triển Khảo sát giống, sự sinh trưởng, phát triển
Lên men rượu
Nhân giống cấp 1
Nhân giống cấp 2
Lên men thu BC
Xử lí BC
Khảo sát CĐ bằng pp nhốt
Khảo sát CĐ bằng pp bẫy-hấp phụ
Khảo sát lên men malolactic bằng vi
khuẩn tự do
Lên men malolactic bằng vi khuẩn cố định Khảo sát tỉ lệ giống Khảo sát thời điểm bổ sung giống Khảo sát thời gian lên men
Lên men với điều kiện tối ưu
Khả năng tái sử dụng của chế phẩm
3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.2.2.1 Khảo sát các đặc điểm về giống vi sinh vật sử dụng trong đề tài
Các chủng vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae, Oenococcus oeni, Acetobacter xylinum lần lượt được kiểm tra:
- Đặc điểm hình thái: quan sát đại thể thông qua quan sát khuẩn lạc sau 4 ngày nuôi cấy và quan sát vi thể các tế bào dưới kính hiển vi ởđộphóng đại 1000 lần.
- Khả năng sinh trưởng và phát triển: xây đựng đường cong sinh trưởng và lập
đường chuẩn của từng giống vi sinh vật.
3.2.2.2 Khảo sát quá trình lên men malolactic bằng chủng
Oenococcus oeni tự do
a. Khảo sát tỉ lệ giống Oenococcus oeni thích hợp để lên men malolactic
Để bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào thực hiện quá trình lên men malolactic ta cần xác định lượng giống vi khuẩn đưa vào sao cho quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất. Chúng tôi tiến hành bổ sung 3 tỉ lệ giống khác nhau là 5%, 7%, 10% vào dịch chanh dây đã lên men rượu 7 ngày và tiến hành lên men malolactic trong 4 ngày.
Sau khi quá trình lên men kết thúc chúng tôi thu mẫu và kiểm tra các chỉ tiêu: pH, hàm lượng chất khô (oBrix), độ acid toàn phần, hàm lượng acid lactic, hàm
lượng acid malic, độrượu.
b. Khảo sát thời điểm thích hợp để bổ sung giống Oenococcus
oeni trong lên men malolactic.
Khi bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào để lên men malolactic sẽ xảy ra sựtương tác giữa nấm men Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Oenococcus oeni.
Tương tác này có thể là kích thích, kìm hãm hoặc trung lập. Xác định các tương tác
này giúp cho việc nghiên cứu, tuyển chọn những giống vi khuẩn malolactic có khả năng thích nghi cao và lên menmalolactic tốt cũng như tăng cường khả năng chống chịu của vi khuẩn trước những ảnh hưởng bất lợi của môi trường là một điều cần thiết. Do đó chúng tôi khảo sát các thời điểm khác nhau để bổ sung vi khuẩn
Sau khi đã có tỉ lệ giống Oenococcus oeni tối ưu, chúng tôi tiến hành bố trí các mẫu thí nghiệm như sau:
- Mẫu ĐC(MĐC): Mẫu đối chứng không bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni.
- Mẫu 0 (M0): Bổsung đồng thời nấm men và vi khuẩn Oenococcus oeni.
- Mẫu 3 (M3): Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 3 của quá trình
lên men rượu (thời điểm nấm men đang phát triển ở pha log).
- Mẫu 5 (M5): Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 5 của quá trình
lên men rượu.
- Mẫu 6 (M6): Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 6 của quá trình lên men rượu.
- Mẫu 7 (M7): Bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni vào ngày thứ 7, sau khi kết thúc quá trình lên men rượu.
Tất cả các nghiệm thức được thu mẫu sau 11 ngày lên men (bao gồm 7 ngày
lên men rượu và 4 ngày lên men malolactic) và kiểm tra các chỉ tiêu: pH, hàm lượng chất khô (oBrix), độ acid toàn phần, hàm lượng acid lactic, hàm lượng acid malic, độ rượu.
c. Khảo sát thời gian lên men malolactic
Sau khi xác định được tỉ lệ giống và thời điểm bổ sung giống vi khuẩn
Oenococcus oeni thích hợp, chúng tôi tiến hành lên men malolatic, khảo sát sự biến thiên của hàm lượng acid lactic, acid malic để chọn ra thời gian lên men thích hợp sao cho sản phẩm có mùi vị tốt nhất.
Bảng 3. 5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian lên men malolactic
Thời gian Acid malic Acid lactic
0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
3.2.2.3 Lên men tạo BC
a. Thu nhận BC
Sơ đồ 3. 1 Sơ đồ thu nhận BC
b. Xử lý BC thô
BC tươi thu được sau lên men chứa một lượng lớn môi trường lên men và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất. Xử lý BC tươi nhằm loại bỏ tạp chất và các tế
bào vi sinh vật để BC trở thành giá thể sạch và trơ.
Sơ đồ 3. 2 Xử lí BC thô
BC thô
Rửa và ngâm nước 1 ngày
Rửa và ngâm nước 1 ngày
Bảo quản lạnh
Nguyên liệu nước dừa già Giống Acetobacter xylinum
Lọc cặn Nhân giống cấp 1
Bổsung dinh dưỡng Nhân giống cấp 2
Thanh trùng (sau đó để nguội)
Cấy giống : 15% giống và 85% môi trường
Lên men tĩnh ( 7- 8 ngày)
c. Phương pháp xác định mật độ tế bào cố định được trên BC
Để xác định được mật độ tế bào vi khuẩn được cố định trên chất mang BC chúng tôi sử dụng đệm phosphate để phá mẫu. Cách tiến hành như sau: cho miếng BC cố định vào trong ống nghiệm chứa sẵn V (ml) dung dịch đệm phosphate 7.1, voltex
đều trong 1 phút rồi để yên trong 5 phút. Sau đó tiến hành đo OD dung dịch phá mẫu.
3.2.2.4 Khảo sát các phương pháp cố định Oenococcus oeni trên chất mang BC
a. Phương pháp hấp phụ
Nguyên tắc: Phương pháp hấp phụđể bẫy giống vi khuẩn cần cốđịnh hấp thụ lên chất mang BC. Sử dụng BC như một giá thể nuôi cấy vi khuẩn với hai giai đoạn:
- Áp dụng phương pháp hấp phụ để bẫy giống vi khuẩn hấp phụ lên chất mang BC.
- Sau quá trình hấp phụ, chất mang BC được trương nở bởi dịch môi trường và tế
bào giống vi khuẩn. Chất mang BC lúc này như một giá thể nuôi cấy vi khuẩn và được tạo điều kiện thích hợp để vi khuẩn phát triển.
Phương pháp cố định tế bào trên chất mang BC bằng phương pháp bẫy - hấp phụ gồm hai giai đoạn: hấp phụ vi khuẩn trên bề mặt BC và bẫy tăng sinh trong chất mang BC.
- Giai đoạn hấp phụ: Ngâm BC trong dịch tế bào trong thời gian 30 phút, BC sẽ trương nở về trạng thái ban đầu, đồng thời sẽ hấp phụ tế bào vào hệ thống sợi bên trong cũng như trên bề mặt bên ngoài.
- Giai đoạn bẫy tăng sinh: Kế tiếp giai đoạn hấp phụ. Các tế bào đã được hấp phụ ở giai đoạn trên tiếp tục phát triển và tăng sinh trên giá đỡ BC.
Tiến hành phương pháp bẫy – hấp phụ
+ Bước 1: Ly tâm thu sinh khối giống
+ Bước 2: Phương pháp bẫy – hấp phụ vi khuẩn trên chất mang BC
Chuyển BC đã xử lý (được cắt nhỏ với kích thước 2cm x 1cm, 2cm x 2cm, 2cm x 3cm) và vô trùng, sinh khối vi khuẩn sau ly tâm thu được vào trong bình erlen 250 ml trong đó chứa 100 ml dịch môi trường Hansen. Với tỷ lệ BC phối trộn tương ứng với
kích thước 2cm x 1cm, 2cm x 2cm, 2cm x 3cm là 3: 2: 1 (45, 30, 15 miếng BC).
- Phương pháp A: ngâm trong thời gian 30 phút đến khi miếng BC trương nở hoàn toàn trong dịch giống.
- Phương pháp B: tương tự phương pháp A nhưng kết hợp sử dụng chếđộ lắc 200 vòng/phút để tăng khả năng hấp phụ tế bào vi khuẩn vào chất mang.
- Phương pháp C: tương tự phương pháp A nhưng tăng số vòng lắc lên là 300 vòng/phút
BC sau khi cố định được chuyển vào các đĩa Petri vô trùng để tiến hành giai
đoạn bẫy tăng sinh.
Cách theo dõi trong và sau quá trình cốđịnh:
- Trong các phương pháp A, B, C xác định phương pháp hấp phụ nào cho hiệu quả
cốđịnh cao nhất.
- Xác định mật độ vi khuẩn phát triển trên chất mang BC trong thời gian ủ. Xác
định thời gian ủ tối ưu.
b. Phương pháp nhốt
Nguyên tắc: Phương pháp nhốt chủđộng tế bào vi khuẩn vào bên trong BC được thực hiện nhờ lực hút trong bình lọc của máy lọc, dịch lỏng và các phân tử có kích thước nhỏhơn lỗ màng dưới tác dụng của lực hút di chuyển xuống bình chân không. Trong khi đó tế bào vi sinh vật có kích thuớc lớn hơn sẽ được giữ lại trong mạng lưới sợi cellulose.
Tiến hành phương pháp nhốt:
Bước 1: Chuẩn bị BC
- Quy trình tạo BC cho phương pháp nhốt cũng tương tựnhư mục 3.2.2.3a nhưng
thay vì lên men trong bảy ngày thì với phương pháp này chúng tôi lên men tạo BC
trong hai ngày trong các đĩa petri. Việc lên men BC trong hai ngày nhằm tạo BC có độ dày tương đối là 2mm.
- Xử lý BC: quy trình xử lý như mục 3.2.2.3b sau đó vắt cho ráo nước và đem hấp tiệt trùng.
Bước 2: Chuẩn bị dịch giống cấp 2
Bước 3: Chuẩn bị bình hút chân không và phễu lọc. Bình hút chân không và phễu lọc phải được vô trùng.
Bước 4: Lấy màng BC của bước 1 đặt lên phễu sứ, sau đó đổ dịch giống cấp 2 vào phễu và bật máy hút chân không để tiến hành nhốt tế bào vi khuẩn vào trong mạng
lưới cellulose.. Quá trình kết thúc khi dịch giống trong phễu đã chảy hết xuống bình lọc.
Cách theo dõi trong và sau quá trình cốđịnh
- Xác định mật độ vi khuẩn cố định trên chất mang BC trong thời gian nhốt bằng
cách xác định mật độ tếbào trước và sau khi cốđịnh.
3.2.2.5 Khảo sát quá trình lên men malolactic bằng chủng
Oenococcus oeni cố định trên chất mang BC
Sau khi đã có kết quả khảo sát quá trình lên men malolactic bằng chủng
Oenococcus oeni tự do và kết quả khảo sát các phương pháp cốđịnh Oenococcus oeni
trên chất mang BC, chúng tôi tiến hành lên men malolactic bằng chủng Oenococcus oeni cố định nhằm đánh giá hiệu quả của việc sử dụng chế phẩm cố định so với chế
phẩm tự do.
Chúng tôi tiến hành lên men rượu dịch chanh dây (7 ngày). Sau đó bổ sung chế
phẩm Oenococcus oeni cốđịnh vào thời điểm đã được xác định ở mục 3.2.2.2a và tiến hành lên men malolactic theo thời gian đã xác định ở mục 3.2.2.2c.
Sau khi hoàn tất quá trình lên men malolactic, chúng tôi thu mẫu để kiểm tra các chỉ tiêu acid malic, acid lactic để xác định hiệu quả lên men và lấy chế phẩm
Oenococcus oeni cốđịnh chuyển sang bình rượu khác để tiếp tục lên men malolactic. Theo dõi số lần tái sử dụng của chế phẩm cốđịnh.
3.2.2.6 Đánh giá chất lượng sản phẩm
Mục đích của quá trình lên men malolactic là làm giảm acid malic nhằm giảm vị chua gắt của sản phẩm. Tuy nhiên, để biết được lượng acid malic giảm bao nhiêu thì sản phẩm có được mùi vị tốt nhất, ngoài việc xác định các thông sốnhư ở trên, chúng tôi cũng tiến hành đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm.
Sau khi đã tối ưu được quá trình lên men malolactic tự do và cốđịnh, chúng tôi tiến hành lên men, tàng trữ, đánh giá cảm quan một lần nữa để biết được chất lượng của sản phẩm. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng gửi mẫu đến Trung tâm phân tích Hải
3.2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm 3.2.3.1 Phương pháp vi sinh 3.2.3.1 Phương pháp vi sinh
a. Đếm khuẩn lạc
Cho phép xác định số tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di
được tính theo công thức sau:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V
Trong đó Ai là số khuẩn lạc trung bình trong 1 đĩa, Dilà độ pha loãng và V là dung dịch huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (0.1ml).
Phương pháp tiến hành.
b. Đếm bằng buồng đếm hồng cầu
Nguyên lý: kích thước tế bào nấm men và vi khuẩn là tương đối lớn nên có thể định lượng số tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
Nguyên tắc: Buồng đếm là những lam kính có khắc rãnh, phân thành mạng
lưới, các ô vuông cực nhỏcó kích thước xác định. Trên mỗi ô vuông giữa lam kính và lame là một thểtích xác định, tuy nhỏ nhưng rất chính xác. Đếm số tế bào trên các ô
Mẫu chứa nấm men
Saccharomyces cerevisiae
Pha loãng mẫu theo dãy thập phân
Ủở 320C 1-2 ngày
Đếm khuẩn lạc trên mỗi đĩa
Đổ 0.1ml mẫu đã pha loãng vào đĩa
dưới kính hiển vi và nhân với thể tích tương ứng có thể quy ra số tế bào vi sinh vật trong một ml mẫu.
Tiến hành
Nếu chồi lớn hơn 1/2 tế bào mẹ thì đếm 2 tế bào. Nếu chồi nhỏhơn 1/2 tế bào mẹ thì đếm 1 tế bào.
Nếu các tế bào vi sinh vật nằm trên cạnh của ô đếm: số lượng tế bào trong 1 ô
đếm bằng số tế bào trong ô đó cộng thêm số tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp của ô
đếm. Kết quả: 4000 1000 ax xb X x c
Với X: lượng tế bào trong 1ml
a: sốlượng tế bào trong 5 ô lớn
b: tỷ lệ pha loãng canh trường (nghịch đảo nồng độ pha loãng) c: số ô nhỏ trong 5 ô lớn (c = 16 x 5 = 80).
Nước Mẫu
Nhỏ lên hai khoang
Pha loãng Đậy lá kính (dùng tay ấn nhẹ) Thấm nước dư Nhỏ lên cạnh buồng đếm Quan sát qua kính Đếm số tế bào trên 5 ô lớn Nước
3.2.3.2 Phương pháp hóa sinh a. Đo OD
Mật độ vi sinh vật có thể được xác định một cách gián tiếp thông qua đo độ đục. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm
môi trường trởnên đục. Độđục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Do vậy, có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độđục bằng máy so màu ở bước sóng 600 - 610nm. Trong trường hợp này, trước tiên cần phải thiếp lập được
đường quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách sử dụng một số
huyền phù tế bào có độ đục xác định và mật độ tế bào của mỗi huyền phù được xác
định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
b. Đo độ rượu
Tiến hành chưng cất hỗn hợp gồm 30ml rượu cần cất và 30 ml nước cho tới khi bình đựng hỗn hợp rượu và nước chỉ còn 30ml thì dừng. Ta tiến hành xác định độrượu bằng phương pháp bình tỷ trọng.
Dựa vào bảng tra nồng độ ethanol nguyên chất theo tỷ trọng, suy ra hàm lượng ethanol trong mẫu chưng cất.
c. HPLC
Đểxác định hàm lượng acid malic và acid lactic ta dùng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Các mẫu được phân tích tại phòng thí nghiệm chuyên hóa sinh học và trung tâm phân tích thí nghiệm TP.HCM.
3.2.3.3 Hóa lý a. pH
Sử dụng máy đo pH để xác định độ pH của mẫu. Sau khi dùng các dung dịch
đệm để chỉnh máy, ta cắm diện cực của máy đo vào dung dịch cần đo và đợi đến khi máy ổn định thì đọc giá trị pH trên máy. Mỗi lần đo chúng tôi đều lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình.
b. Brix
Sử dụng khúc xạ kế cầm tay, đơn vị đo là oBx đểxác định hàm lượng chất khô có trong dung dịch. Lau khô mặt kính của khúc xạ kế, khuấy đều dung dịch cần đo và
lấy 1 giọt nhỏ lên mặt kính (tránh để bọt khí), quan sát rồi đọc kết quả. Lặp lại 3 lần để
3.2.3.4 Khác
* Cảm quan
Phương pháp phân tích cảm quan.
Chất lượng cảm quan sản phẩm được đánh giá bằng phương pháp so sánh cặp theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 3215 – 79).
Đối với sản phẩm đồ uống có cồn nói chung và sản phẩm đồ uống có cồn lên men thì các chỉ tiêu cảm quan quan trọng cần đánh giá gồm: độ trong và màu sắc, mùi,