Để tránh các tác động môi trường như: nhiệt độ, thời gian, … ảnh hưởng tới quá trình chiết cũng như tới hoạt độ pectinase, tiến hành thí nghiệm xác định
thời gian chiết tối ưu. Với cùng một loại dung môi chiết (nước cất) ứng với tỷ lệ
dung môi chiết thích hợp (3/1), cho thay đổi thời gian chiết bằng cách sau một khoảng thời gian chiết nhất định lấy dịch enzyme pectinase ra đem lọc rồi xác
định hoạt độ pectinase và chọn thời gian chiết tối ưu. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trên hình 3.8. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 20 30 40 50 60 70 80 Thời gian chiết (phút) H ( H đ P E/ m l d ị ch ch i ế t en zy m e)
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt độ pectinase trong quá trình chiết pectinase
Từ đồ thị nhận thấy: càng tăng thời gian chiết (trong khoảng thí nghiệm) thì hoạt độ pectinase càng tăng (tăng lần lượt là 8.02%, 42.66% ở giá trị 30 phút, 40 phút so với giá trị 20 phút ban đầu) nhưng chỉ tăng tới một giới hạn nhất định,
đạt cực đại tại 50 phút (1.164 - tăng 76.1% so với giá trị 20 phút). Nếu tiếp tục tăng thời gian chiết thì hoạt độ pectinase lại giảm (giảm lần lượt 10.48%, 32.47%, 36.43% ở giá trị 60 phút, 70 phút, 80 phút so với giá trị cực đại).
Khi thời gian chiết tăng thì lượng chất khuếch tán tăng và ngược lại. Lúc
đầu, khi thời gian chiết còn ít chưa đủđể pectinase khuếch tán và hòa tan triệt để
vào dung môi, lượng enzyme pectinase khuếch tán vào nước cất ít, hoạt độ
pectinase của 1ml dung dịch còn thấp. Thời gian phải đảm bảo đủđể pectinase có thể hòa tan tối đa vào dung môi, khi đó hoạt độ pectinase đạt cao nhất. Khi thời gian chiết tăng thì lượng pectinase khuếch tán vào dung môi tăng lên nên hoạt độ
pectinase của 1ml dung dịch tăng. Nhưng khi lượng pectinase trong canh trường
đã khuếch tán hết vào dung môi, nếu tiếp tục kéo dài thời gian thì hoạt độ của nó lại giảm dưới tác động của các yếu tố khác của môi trường như nhiệt độ, pH, các
tạp chất khác từ chế phẩm thô hòa tan vào dung môi. Từđó làm giảm hoạt độ của pectinase, lại không đem lại hiệu quả kinh tế khi thời gian chiết kéo dài. Tại thời gian chiết 50 phút là khoảng thời gian vừa đủ để lượng pectinase khuếch tán hết vào dung môi mà không chịu các tác động của các yếu tố môi trường như: nhiệt
độ, pH, các tạp chất khác từ chế phẩm thô hòa tan vào dung môi làm giảm hoạt
độ pectinase.
Vì vậy, chọn thời gian chiết là 50 phút.
3.3.2. Kết quả xác định điều kiện kết tủa pectinase từ dịch chiết 1. Kết quả xác định dung môi kết tủa enzyme thích hợp
Với mỗi loại dung môi thì hiệu quả kết tủa enzyme là khác nhau và mức
độ làm giảm hoạt tính enzyme là khác nhau. Điều quan trọng là phải chọn được loại dung môi kết tủa bảo toàn được hoạt tính enzyme nhất mà hiệu quả kết tủa
đối với enzyme tốt nhất tức là kết tủa được nhiều enzyme nhất. Tiến hành kết tủa enzyme bởi các dung môi: ethanol 960, acetone 99.5%, (NH4)2SO4 bão hòa (539.83g/lít).
Tỷ lệ dung môi/dịch chiết enzyme là 3/1, thời gian chiết là 50 phút, thời gian kết tủa là 30 phút. Tiến hành xác định hoạt độ pectinase, khối lượng kết tủa thu được và chọn dung môi kết tủa thích hợp. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở
bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau tới hoạt độ pectinase trong quá trình kết tủa pectinase
Loại dung môi Ethanol 960 Acetone (NH4)2SO4
Lượng enzyme thu được (g/100ml dịch chiết) 1.25 1.125 0.810 H (HđPE/g chế phẩm) 31.25 35.938 29.688 Hoạt độ tương đối so với trước khi kết tủa(%)
Từ bảng 3.3 cho thấy, dùng dung môi acetone để kết tủa pectinase là tốt nhất, vì hoạt độ của 1g chế phẩm pectinase là lớn nhất và giữ được hoạt độ
pectinase cao nhất.
Kết quả cho thấy tác nhân acetone cho hoạt độ chế phẩm pectinase cao nhất (35.938) và giữ được hoạt độ enzyme tương đối so với trước kết tủa cũng cao nhất (68.09%), tác nhân ethanol cho hoạt độ chế phẩm pectinase cao hơn so với tác nhân (NH4)2SO4 (với ethanol có hoạt độ 31.25 và hoạt độ tương đối so với trước kết tủa là 65.79% còn với (NH4)2SO4 có hoạt độ 29.688 và hoạt độ
tương đối so với trước kết tủa là 40.5%). Sự biến tính enzyme pectinase bởi các tác nhân kết tủa là do các tác nhân này làm biến tính không thuận nghịch pro - enzyme làm thay đổi cấu trúc không gian từ đó làm bất hoạt chúng. Khi có mặt các dung môi này thì hằng số điện môi giảm, phân tử enzyme có thể tự tháo gỡ
làm cho các gốc kỵ nước tiếp xúc với dung môi, tức là cấu trúc không gian của phân tử enzyme bị thay đổi (bình thường các gốc phân cực phân bố đều trên bề (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mặt phân tử protein, còn các gốc kỵ nước không phân cực thì nằm trong lòng phân tử) tạo thành dạng không hoạt động. Nhưng (NH4)2SO4 làm giảm hoạt động của pectinase hơn có thể là do chúng ta khó loại bỏ được (NH4)2SO4 ra khỏi chế
phẩm làm ảnh hưởng tới hoạt độ pectinase, còn cồn khó bay hơi hơn acetone, thời gian tiếp xúc với pectinase kéo dài hơn nên làm giảm hoạt độ pectinase hơn. Mặt khác, với ethanol thì lượng enzyme kết tủa là cao nhất có thể do hiệu quả kết tủa pectinase của ethanol cao (ethanol gây mất nước mạnh đối với enzyme), nhưng thời gian tiếp xúc giữa ethanol và pectinase có thể làm giảm hoạt tính cao hơn so với thời gian tiếp xúc giữa acetone và pectinase. Sự giảm hoạt độ
pectinase phụ thuộc vào nhiệt độ và thời gian tiếp xúc. Để giảm hiện tượng bất hoạt enzyme khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ thì phải làm lạnh dung dịch đến 00C - 50C.
Khi sử dụng các tác nhân kết tủa enzyme sẽ làm giảm hoạt tính enzyme do chúng bị biến tính không thuận nghịch và không có khả năng phục hồi hoạt tính xúc tác khi loại bỏ tác nhân gây biến tính. Đối với mỗi loại tác nhân gây kết tủa
khác nhau sẽ thu được chế phẩm enzyme có hoạt độ khác nhau ứng với mỗi loại enzyme khác nhau. Mỗi enzyme sẽ có loại tác nhân kết tủa thích hợp, khi đó CP enzyme thu được sẽ có hoạt độ cao nhất. Theo Đỗ Văn Ninh [13], acetone cũng là tác nhân kết tủa thích hợp đối với protease trong nội tạng cá và mực. Tuy nhiên đối với protease từ Aspergillus oryzae thì tác nhân kết tủa thích hợp lại là (NH4)2SO4 [5], protease từBacillus subtilis S5 thì tác nhân kết tủa thích hợp lại là ethanol [1].
Vì thế, chọn acetone làm dung môi kết tủa pectinase.
2. Kết quả xác định tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme
Sau khi lựa chọn acetone làm dung môi kết tủa dịch chiết enzyme pectinase, tiến hành xác định tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme. Vì ứng với mỗi tỷ
lệ acetone/dịch chiết enzyme nhất định thì khả năng kết tủa enzyme cũng như
mức độảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme khác nhau.
Cốđịnh các thông số: các thông số trong quá trình chiết, thời gian kết tủa là 30 phút và cho thay đổi tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme. Tiến hành xác định hoạt độ pectinase và chọn tỷ lệ dung môi kết tủa thích hợp. Kết quả thí nghiệm
được thể hiện trên hình 3.9. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1.5/1 2.0/1 2.5/1 3.0/1 3.5/1 4.0/1 5.0/1
Tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme
H ( H đ P E /g C P K T )
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme đến hoạt độ
pectinase trong quá trình kết tủa pectinase
Từ biểu đồ cho thấy: càng tăng lượng acetone lên (trong khoảng thí nghiệm) thì hoạt độ pectinase càng tăng (tăng 29.31% ở giá trị 2/1 so với giá trị
1.5/1) và đạt cực đại tại giá trị 2.5/1 (46.354 - tăng 53.45% so với giá trị 1.5/1). Acetone sẽ lấy nước của phân tử enzyme, làm giảm hằng sốđiện môi của chúng từ đó làm kết tủa enzyme pectinase. Khi tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme còn ít không đủ để kết tủa hết lượng pectinase có trong dịch chiết nên lượng pectinase kết tủa thu được ít, hoạt độ pectinase thấp. Khi tăng lượng acetone lên thì lượng enzyme pectinase tiếp xúc với tác nhân kết tủa (acetone) lớn, lượng pectinase
được kết tủa triệt để hơn, hoạt độ cao hơn. Tại giá trị 2.5/1 thì lượng pectinase có trong dịch chiết và acetone được tiếp xúc tối đa và vừa đủ nên hoạt độ tại giá trị
này cũng cao nhất (46.354). Tuy nhiên, nếu càng tăng tỷ lệ acetone lên thì hoạt
độ pectinase lại giảm (giảm lần lượt 22.47%, 68.54% ở giá trị 3/1 và 3.5/1 so với giá trị cực đại). Điều này có thể do khi đã kết tủa hết lượng pectinase có trong dịch chiết mà vẫn tiếp tục cho acetone vào thì có thể dung môi này gây mất nước mạnh đối với protein - enzyme làm biến tính không thuận nghịch enzyme từ đó làm giảm hoạt độ pectinase nhưng đồng thời cũng tiêu tốn lượng acetone lớn hơn, tăng thêm chi phí. Ở các tỷ lệ 4/1 và 5/1 thì hoạt độ pectinase không thể
giảm hơn được nữa (68.54% so với giá trị cực đại) có thể là do acetone đã tác
động hết các gốc ưa nước của protein - enzyme gây biến tính không thuận nghịch tới protein - enzyme nên dù cho lượng acetone lớn mà hoạt độ pectinase không giảm hơn được nữa.
Vì thế, chọn tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme là 2.5/1.
3. Kết quả xác định thời gian kết tủa enzyme thích hợp
Sau khi lựa chọn dung môi kết tủa và tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme thích hợp, để tránh tác động của môi trường tới quá trình kết tủa cũng như hoạt
độ pectinase như: dung môi kết tủa, thời gian kết tủa cũng như thời gian enzyme tiếp xúc với dung môi kết tủa, …. Tiến hành xác định thời gian kết tủa thích hợp. Cốđịnh các thông số: các thông số trong quá trình chiết, tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme là 2.5/1 và cho thay đổi thời gian kết tủa. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trên hình 3.10.
Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ pectinase trong quá trình kết tủa pectinase
Từđồ thị nhận thấy: càng tăng thời gian kết tủa (trong khoảng thí nghiệm) thì hoạt độ pectinase tăng (tăng 11.29% ở giá trị 10 phút so với giá trị 5 phút) và (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đạt cực đại tại giá trị 15 phút (56.25 - tăng 74.19%). Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng thời gian kết tủa lên thì hoạt độ pectinase lại giảm (giảm lần lượt 33.33%, 44.44%, 47.22% ở các giá trị 20 phút, 30 phút và 40 phút so với giá trị cực đại). Khi thời gian kết tủa chưa đủ thì chưa thể kết tủa hết lượng pectinase có trong dịch chiết nên khi tăng thời gian kết tủa, hoạt độ cũng như lượng pectinase thu
được cũng tăng. Tại thời gian kết tủa là 15 phút thì lượng pectinase được kết tủa tối đa, đủ thời gian để acetone tiếp xúc và kết tủa pectinase. Khi lượng pectinase trong dịch chiết đã được kết tủa hết, nếu tiếp tục tăng thời gian kết tủa thì dưới tác động của các yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH, thời gian và có thể acetone làm giảm hoạt độ của pectinase khi thời gian tiếp xúc dài. Từ đó làm giảm hoạt
độ cũng như lượng pectinase thu được.
Như vậy, các điều kiện trong quá trình tách chiết pectinase là: nước cất là dung môi chiết enzyme pectinase, tỷ lệ nước cất/CP thô 3/1, thời gian chiết 50 phút, acetone là dung môi kết tủa enzyme pectinase, tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme 2.5/1, thời gian kết tủa 15 phút. 0 10 20 30 40 50 60 5 10 15 20 25 30 35 40 H ( H đ P E /g C P K T ) Thời gian kết tủa (phút)
3.4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH NUÔI CẤY ASP.NIGER SINH PECTINASE TRÊN MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN LÀ BÃ THẢI CÀ RỐT TRÊN MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN LÀ BÃ THẢI CÀ RỐT
Từ kết quả trên cho phép đề xuất quy trình nuôi cấy Asp.niger sinh pectinase như sau:
Sơđồ quy trình:
Diễn giải quy trình:
− Chuẩn bị môi trường:
Tỷ lệ các thành phần môi trường theo kết quả nghiên cứu trên đây, gồm cám gạo 52.63%, trấu 10.53%, bã cà rốt 36.84%, (NH4)2SO4 3% (theo KLMTTN). Do các thành phần trên tính theo KLMTTN, nên tùy thuộc độ ẩm MT ban đầu để tính quy đổi ra khối lượng thực tế của từng thành phần. Chọn cám gạo chất lượng tốt, không mùi ôi khét, không mốc, hàm lượng tinh bột không dưới 20%; bã cà rốt không mốc, không mùi chua, không biến màu; (NH4)2SO4 không vón cục. Các thành phần trên (sau khi tính toán theo yêu cầu) thì trộn đều. Sau đó làm ẩm môi trường bằng nước cất đểđạt độẩm 56%.
Lượng nước cần thiết thêm vào được xác định theo công thức sau:
44 56 . ) 56 100 ( 56 . G G N = − =
Chuẩn bị môi trường
Thanh trùng ở 1210C/15 phút
Nuôi mốc trên khay ở nhiệt độ
320C, độẩm 56%, 35h Cấy mốc giống Thu nhận và bảo quản Mốc giống Asp.niger Nhân giống Bã cà rốt Cám Trấu (NH4)2SO4
Với:
N: lượng nước cần cho vào (l)
G: khối lượng môi trường khô tuyệt đối (kg)
− Thanh trùng môi trường:
Mục đích để làm chín môi trường, chuyển hóa các chất dinh dưỡng từ
dạng phức tạp sang dạng đơn giản dễ hấp phụ. Đồng thời còn tiêu diệt các vi sinh vật tạp nhiễm trong môi trường nuôi cấy. Thanh trùng môi trường bằng hơi nước
ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút.
− Làm nguội môi trường:
Sau khi thanh trùng, làm nguội môi trường trong phòng vô trùng đến nhiệt
độ 320C, làm tơi và trải đều lên khay men thành mỏng với bề dày lớp môi trường khoảng 3 - 5cm.
− Chuẩn bị mốc giống:
Trộn cám, bã cà rốt, trấu với nước với tỷ lệ 1/1/0.05/0.2 đểđảm bảo độẩm khoảng 58%. Chuẩn bị ba bình tam giác 250ml, cho 100g môi trường như trên đi hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút và để nguội. Sau đó, chuyển toàn bộ bào tử từ ống giống gốc bằng cách cho vào mỗi ống nghiệm 10ml nước vô trùng và khuấy đều cho bào tử giống trong ống nghiệm hòa trộn trong nước. Chuyển toàn bộ sang các bình tam giác đã chuẩn bị sẵn, lắc đều cho môi trường trộn đều bào tử. Nuôi ở nhiệt độ 30 - 370C trong 3 ngày, khi thấy trong bình tam giác toàn bào tửđen thì dừng nuôi.
Tiếp đó, chuẩn bị sẵn môi trường như trên, thanh trùng môi trường và chuyển chúng vào các khay nhôm hoặc inox và tãi đều môi trường sau khi cho 10% giống từ bình tam giác đã nuôi ở trên vào, bề dày MT sau trộn giống 3 - 5cm. Để khay trong phòng có nhiệt độổn định 320C trong 3 - 4 ngày khi bào tử đen xuất hiện kín bề mặt môi trường. Sau đó, sấy môi trường ở nhiệt độ 390C trong 8h và thu được bào tử giống sẵn sàng cho sản xuất đại trà.
− Nuôi mốc trên khay: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trộn đều mốc giống và môi trường với tỷ lệ 0.5% (so với KLMTTN) thì ủ
thành đống, để tạo điều kiện thuận lợi cho bào tử nảy mầm, thời gian ủ từ 5 - 8h. Sau đó trải đều môi trường đã cấy mốc thành lớp dày từ 3 - 5cm trên khay men sạch và đặt vào phòng nuôi cấy có sẵn các giá đỡ. Lúc này cần thông khí tốt cho môi trường để tạo điều kiện cho mốc phát triển trong giai đoạn đầu. Sau thời gian từ 10 - 12h, mốc sẽ phát triển thành hệ sợi, làm cho môi trường kết bánh lại. Do vậy, cần đảo trộn và thông khí thường xuyên vì ở giai đoạn này mốc phát triển mạnh, tỏa nhiệt làm tăng nhiệt độ môi trường và giảm độ ẩm. Ta cần thông khí và phun nước dưới dạng sương vào phòng nuôi để đảm bảo nhiệt độ ổn định ở
mức 320C, độẩm môi trường ở mức 56%. Thời gian nuôi mốc là 35h, khi đó bắt
đầu xuất hiện bào tử có màu đen cà phê. Để tránh vi sinh vật nhiễm tạp trong quá trình nuôi cấy thì các dụng cụ phải sạch sẽ, trước mỗi lần sử dụng phải tiệt trùng. Phòng nuôi cấy phải sạch, sau mỗi chu kỳ nuôi cấy phải được chiếu tia cực tím