Cố định hàm lượng trấu, tỷ lệ giống, bã cà rốt và độ ẩm môi trường ban
đầu đã tìm được ở thí nghiệm trên, thay đổi hàm lượng cám cho vào môi trường với các tỷ lệ % (so với KLMTTN) sau:
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 7a 8a 9a 10a 11a 12a 13a 14a 15a 16a 17a 18a 43.75% 47.06% 50% 52.63% 55% 57.14% 59.09% 60.87% 62.5% 64% 65.39% 66.67%
Thí nghiệm xác định hàm lượng cám bổ sung được bố trí như sau:
3. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ giống cho vào môi trường
Sau khi nhân giống cấp 2 trong bình tam giác với MT gồm: cám, trấu, bã cà rốt, nước với các tỷ lệ khối lượng là 1/0.05/1/0.2. Như vậy, khối lượng giống cho vào MT bao gồm cả bào tử của Asp.niger và MT mà chúng chưa sử dụng hết. Cốđịnh hàm lượng trấu, bã cà rốt, độ ẩm và hàm lượng cám đã tìm được
ở các thí nghiệm trên, cho thay đổi tỷ lệ giống: 0.2%, 0.5%, 0.7%, 1%, 2%, 5%, 7%, 10% (so với KLMTTN). Thí nghiệm xác định tỷ lệ giống được bố trí theo sơ đồ sau: 12 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 Nuôi cấy Asp.niger trên MT có hàm lượng cám khác nhau Xác định hoạt độ pectinase Hàm lượng cám thích hợp
4. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng (NH4)2SO4 bổ sung
Cố định hàm lượng trấu, bã cà rốt, cám và tỷ lệ giống đã tìm được ở thí nghiệm trên, cho thay đổi hàm lượng (NH4)2SO4. Thí nghiệm bổ sung (NH4)2SO4 được bố trí làm 9 mẫu tương ứng với các tỷ lệ (NH4)2SO4 (so với KLMTTN) sau: 0%, 0.5%, 1.0%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%.
Thí nghiệm bổ sung (NH4)2SO4 được bố trí như sau: Xác định hoạt độ pectinase Tỷ lệ giống thích hợp 0.2% 0.5% 0.7% 1% 2% 5% 7% 10% giống khác nhau Xác định hoạt độ pectinase Hàm lượng (NH4)2SO4 thích hợp Nuôi cấy
Asp.niger trên MT có hàm lượng
(NH4)2SO4 khác nhau
5. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ môi trường tối ưu
Cố định các thông số về thành phần môi trường (cám, trấu, bã cà rốt, (NH4)2SO4) và tỷ lệ giống đã tìm được ở trên, cho thay đổi nhiệt độ môi trường. Thí nghiệm xác định nhiệt độ môi trường tối ưu được bố trí làm 7 mẫu tương ứng với 7 nhiệt độ môi trường khác nhau: 280C, 300C, 320C, 340C, 360C, 380C, 400C.
Thí nghiệm xác định nhiệt độ môi trường tối ưu được bố trí như sau:
6. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy tối ưu
Cốđịnh các thông số về thành phần môi trường đã tìm được ở trên (cám, trấu, bã cà rốt, (NH4)2SO4), tỷ lệ giống và nhiệt độ môi trường. Thí nghiệm xác
định thời gian nuôi cấy tối ưu được bố trí làm 11 mẫu tương ứng với thời gian nuôi cấy khác nhau: 28h, 30h, 32h, 34h, 35h, 36h, 37h, 38h, 39h, 40h, 46h.
Thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy được bố trí như sau: Xác định hoạt độ
pectinase
Nhiệt độ môi trường thích hợp 280C
Nuôi cấy
Asp.niger trên MT có nhiệt độ
môi trường khác nhau
7. Bố trí thí nghiệm xác định dung môi chiết enzyme thích hợp
Thí nghiệm được bố trí làm 3 mẫu tương ứng với 3 loại dung môi chiết:
− Nước cất
− Dung dịch NaCl 1%
− Dung dịch đệm acetate pH = 6.5
Sau đó, đem lọc trên giấy lọc và định mức dịch chiết enzyme tới 100ml. Tiến hành chiết với tỷ lệ dung môi chiết/CP enzyme là 5/1, thời gian chiết là 60 phút. Tiến hành xác định hoạt độ pectinase và chọn ra loại dung môi chiết thích hợp nhất. Thí nghiệm xác định loại dung môi chiết pectinase được bố trí như sau:
Xác định hoạt độ pectinase Thời gian nuôi cấy thích hợp 28h 30h 32h 34h 35h 36h 37h 38h 39h 40h 46h Chiết enzyme bằng Nước cất Dung dịch NaCl 1% Dung dịch đệm acetate pH = 6.5
Dung môi chiết enzyme
thích hợp
Xác định hoạt độ
pectinase
8. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi chiết enzyme/chế phẩm thô
Cốđịnh loại dung môi chiết pectinase đã tìm được ở thí nghiêm trên, thời gian chiết là 60 phút và cho thay đổi tỷ lệ dung môi chiết/chế phẩm thô. Thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi chiết enzyme /CP thô được bố trí như sau:
9. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp
Để xác định thời gian chiết thích hợp, cố định dung môi chiết và tỷ lệ
dung môi chiết enzyme/CP thô đã tìm được ở thí nghiệm trên, cho thay đổi thời gian chiết. Thí nghiệm xác định thời gian chiết pectinase thích hợp được bố trí như sau:
10. Bố trí thí nghiệm xác định dung môi kết tủa enzyme thích hợp
Chế phẩm enzyme thô
Chiết enzyme với tỷ lệ dung môi/CP
thô khác nhau Xác định hoạt độ pectinase Tỷ lệ dung môi/CP thô thích hợp 2/1 3/1 4/1 5/1 6/1 Chế phẩm enzyme thô
Chiết enzyme với thời gian
chiết khác nhau Thời gian chiết thích hợp 20 phút 40 phút phút 50 60 phút 70 phút 80 phút 30 phút Xác định hoạt độ pectinase
Tiến hành thí nghiệm với 3 mẫu, mỗi mẫu 100ml dịch chiết pectinase đã làm lạnh đến 50C, rồi đem kết tủa với các dung môi (đã làm lạnh tới 50C) sau:
− Mẫu 1: dùng ethanol 960
− Mẫu 2: dùng acetone (99.5%)
− Mẫu 3: dùng dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa (539.83g/lít)
Các thông số đã được xác định trong quá trình chiết pectinase ở các thí nghiệm trên được cố định. Tỷ lệ dung môi kết tủa/dịch chiết enzyme là 3/1, thời gian kết tủa là 30 phút. Sau đó đem ly tâm với vận tốc góc ω = 3000 vòng/phút, nhiệt độ 50C và thời gian 15 phút. Lọc lấy kết tủa, đem kết tủa làm khô ở nhiệt độ
390C trong tủ sấy chân không với PCK = 0.8 ± 0.05 at, thời gian là 8h. Sau khi làm khô xong, đem cân lượng enzyme thu được ở các mẫu và tiến hành xác định hoạt độ pectinase của chế phẩm enzyme thu được. Thí nghiệm lựa chọn dung môi kết tủa enzyme pectinase được bố trí như sau:
11. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi kết tủa/dịch chiết enzyme
Thí nghiệm được bố trí làm 7 mẫu tương ứng với các tỷ lệ dung môi kết tủa/dịch chiết enzyme: 1.5/1, 2/1, 2.5/1, 3/1, 3.5/1, 4/1, 5/1. Cốđịnh các thông số
trong quá trình chiết pectinase, dung môi kết tủa đã tìm được ở thí nghiệm trên và thời gian kết tủa 30 phút. Tiến hành xác định hoạt độ pectinase thu được và
(NH4)2SO4 Cồn 960 Aceton 99.5% Xác định hoạt độ pectinase Dung môi kết tủa thích hợp Chế phẩm enzyme thô Kết tủa enzyme bằng Chiết enzyme
chọn tỷ lệ dung môi kết tủa/dịch chiết enzyme thích hợp. Thí nghiệm xác định tỷ
lệ dung môi kết tủa/dịch chiết enzyme được bố trí như sau:
12. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian kết tủa enzyme thích hợp
Thí nghiệm được bố trí làm 8 mẫu tương ứng với thời gian kết tủa khác nhau. Cố định các thông số: các thông số trong quá trình chiết pectinase, dung môi kết tủa và tỷ lệ dung môi kết tủa/dịch chiết enzyme đã tìm được ở các thí nghiệm trên. Tiến hành xác định hoạt độ pectinase thu được và chọn thời gian kết tủa pectinase thích hợp. Thí nghiệm xác định thời gian kết tủa pectinase được bố
trí như sau: Chiết enzyme Kết tủa enzyme với thời gian kết tủa khác nhau Xác định hoạt độ pectinase Thời gian kết tủa thích hợp 5 ph 10 ph 15 ph 20 ph 25 ph 30 ph 35 ph 40 ph Chế phẩm enzyme thô Chế phẩm enzyme thô Kết tủa enzyme với tỷ lệ dung môi/dịch chiết enzyme khác nhau
1.5/1 2/1 2.5/1 3/1 3.5/1 4/1 5/1
Xác định hoạt độ pectinase Tỷ lệ dung môi kết tủa thích hợp
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CƠ BẢN CỦA PHẾ LIỆU CÀ RỐT CỦA PHẾ LIỆU CÀ RỐT
Bã cà rốt thu được sau khi ép cà rốt tươi trên máy ép hoa quả. Khi đem phân tích thành phần của bã cà rốt sau khi ép ta có kết quả sau:
Bảng 3.1. Thành phần cơ bản của phế liệu cà rốt
Nước Khoáng Nitơ tổng số Pectin 87.77% 0.8% 0.18% 3.5%
Trong thành phần của phế liệu cà rốt này vẫn còn khá nhiều chất dinh dưỡng như nguồn nitơ, cacbon, vitamin và khoáng chất. Các thành phần trong bã cà rốt sẽ cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật: cung cấp nitơ cho vi sinh vật sinh tổng hợp các acid amin cũng như enzyme, nguồn khoáng và vitamin sẽ
thúc đẩy cũng như cung cấp nhu cầu cần thiết cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển, đặc biệt là pectin – đây là cơ chất cảm ứng cho vi sinh vật sinh tổng hợp pectinase.Vì thế, môi trường có chứa bã cà rốt hoàn toàn có thể sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp pectinase.
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN VÀ THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY, SẢN XUẤT TRƯỜNG THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY, SẢN XUẤT PECTINASE TỪ ASP.NIGER TRÊN MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN LÀ BÃ THẢI CÀ RỐT
Với đặc tính của cơ thể sống trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển, vi sinh vật không ngừng trao đổi chất với môi trường. Do đó, mỗi biến đổi của môi trường bên ngoài đều tác động trực tiếp đến hoạt động sống của vi sinh vật. Chính vì thế, cần tiến hành tối ưu các điều kiện môi trường cho Asp.niger sinh tổng hợp pectinase.
3.2.1. Kết quả xác định độ ẩm môi trường ban đầu thích hợp cho quá trình nuôi cấy nuôi cấy
Độ ẩm môi trường có ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng phát triển của vi sinh vật, do thành phần chính của vi sinh vật là nước và nguyên sinh chất là dung môi hòa tan hầu hết các cấu tử và là nơi xảy ra mọi chuyển đổi hóa sinh trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Nhu cầu về nước của mỗi loài vi sinh vật khác nhau và được đánh giá qua giá trị aw.
ot wt w P P a = Với: aw: hoạt độ nước ởđiều kiện Pwt và Pwt
Pwt: áp suất hơi riêng phần của nước tại nhiệt độ t POt: áp suất hơi bão hòa của nước tại nhiệt độ t
Đối với nấm mốc, chúng phát triển tốt ởđộẩm 53 – 54% [4 - tr 116], 50 – 60% [9 – tr 144]. Ảnh hưởng của hàm ẩm tới quá trình sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger phụ thuộc vào độ ẩm môi trường ban đầu, độ ẩm của không khí xung quanh nhưng ở đây ta chỉ xét yếu tố độ ẩm môi trường ban đầu. Cố định các thông số: hàm lượng cám 52.63%, trấu 10.53%, bã cà rốt 36.84%, tỷ lệ giống 5.26% (so với KLMTTN), nhiệt độ 300C, thời gian nuôi cấy 32h. Cho thay đổi
độẩm môi trường ban đầu trong khoảng (50% - 60%) bằng cách điều chỉnh hàm lượng nước bổ sung:
) 100 ( . W W G N − = Với:
N: lượng nước cần cho vào (l)
G: khối lượng môi trường khô tuyệt đối (kg) W: độẩm môi trường ban đầu (%)
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 50 52 54 56 58 60 Độẩm (%) H (H đ P E /g C P th ô)
Hình 3.1. Ảnh hưởng của độẩm môi trường ban đầu tới khả năng sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger
Trong quá trình sinh trưởng của nấm mốc, chúng sẽ chuyển hóa các chất và thải nhiệt ra môi trường xung quanh đồng thời làm giảm hàm ẩm của môi trường, môi trường sẽ trở nên khô đi.
Từ biểu đồ cho thấy độẩm môi trường ban đầu có ảnh hưởng rõ rệt tới sự
hình thành pectinase của Asp.niger. Càng tăng lượng ẩm thì hoạt độ pectinase càng tăng: ở 50% là 0.583 nhưng tới 54% là 0.646 (tăng 10.81%) và đạt cực đại khi độ ẩm ban đầu tại 56% (0.656 – tăng 12.52%), nếu độ ẩm môi trường ban
đầu tiếp tục tăng thì hoạt độ pectinase lại giảm, chỉ còn xấp xỉ 11/12 hoặc 4/5 so với cực đại khi độẩm ban đầu là 58 - 60%.
Khi hàm ẩm thấp sẽ ảnh hưởng đến quá trình hấp thu dinh dưỡng, quá trình sinh trưởng và phát triển kém, nấm mốc dễ sinh bào tử, ảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa các chất trong đó có cơ chất pectin, từđó gây ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp enzyme pectinase. Đồng thời độ ẩm thấp cũng làm cho môi trường dễ bị cháy khét, vón khi thanh trùng do có cám nên khi môi trường có độ ẩm thấp thì cám sẽ ngăn cản nhiệt truyền vào bên trong. Từ đó cũng làm giảm khả năng hấp thụ của vi sinh vật. Khi môi trường có độẩm quá cao sẽ gây ra hiện tượng “bết” (do có cám) làm môi trường thiếu không khí và dễ gây tạp nhiễm
hoạt độ pectinase. Tại độ ẩm 56% có thể là giá trị thích hợp cho quá trình trao
đổi chất, chuyển hóa các chất trong đó có pectin, vi sinh vật sẽ tiết ra nhiều pectinase phân giải pectin và hấp thu vào cơ thể, làm khả năng sinh tổng hợp pectinase cao, hoạt độ pectinase cũng cao nhất.
Như vậy, chọn độẩm môi trường ban đầu là 56%.
3.2.2. Kết quả xác định hàm lượng cám bổ sung vào môi trường nuôi cấy
Bổ sung cám vào môi trường vừa nhằm mục đích giảm giá thành vừa cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật. Cám gạo được sử dụng nhiều trong nuôi cấy vi sinh vật, nó có một số ưu điểm như: chứa đủ chất dinh dưỡng cho phát triển vi sinh vật đặc biệt chứa nhiều vitamin B1, B2, B6, Biotin, nấm mốc phát triển mạnh trong MT có cám gạo, rẻ, khi tạo MT thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu [9]. Với môi trường cơ bản là bã cà rốt thì không
đủ nguồn dinh dưỡng (như cacbon, nitơ, …) cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển cũng như sinh tổng hợp enzyme. Vì thế, cần phải bổ sung một lượng cám nhất định nhưng không được quá nhiều vì có thể gây cháy khét và bị vón khi thanh trùng môi trường làm vi sinh vật khó đồng hóa các chất.
Các thành phần như: hàm lượng trấu 10.53%, bã cà rốt 36.84%, tỷ lệ giống 5.26% (so với KLMTTN), độẩm 56%, nhiệt độ 300C, thời gian nuôi cấy 32h được cố định. Cho thay đổi hàm lượng cám, xác định hoạt độ pectinase thu được và chọn hàm lượng cám tối ưu.
Trong thành phần cám chứa tới 40.3 - 42% glucid tổng số, 10 - 12.2% protein thô. Như vậy, cám sẽ bổ sung nguồn cacbon chủ yếu cho môi trường và một phần nitơ. Càng tăng hàm lượng cám thì càng tăng nguồn cacbon cho môi trường nuôi cấy.
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 43 .8 47 .1 50 52 .6 55 57 .1 59 .1 60 .9 62 .5 64 65 .4 66 .7 Hàm lượng cám (% theo KLMTTN) H (H đ P E /g C P th ô)
Hình 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng cám tới khả năng sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger
Từ biểu đồ cho thấy: hàm lượng cám càng tăng thì tỷ lệ C/N càng tăng, tỷ
lệ pectin/C càng giảm, và tăng dần tới tỷ lệ môi trường cân đối, môi trường cung cấp đủ dinh dưỡng cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển cũng như sinh tổng hợp enzyme làm hoạt độ pectinase tăng và đạt cực đại khi lượng cám là 52.63% (theo KLMTTN). Nhưng nếu tiếp tục tăng lượng cám lên thì tỷ lệ C/N tăng, tỷ lệ
pectin/C giảm, lượng pectin giảm dẫn đến vi sinh vật sẽ không ưu tiên sinh tổng hợp pectinase mà chúng ưu tiên sinh tổng hợp amylase (vì Asp.niger có khả năng sinh cả pectinase và amylase) từ đó làm giảm hoạt độ pectinase. Đồng thời, khi hàm lượng cám tăng thì càng gây khó khăn cho sự truyền nhiệt trong quá trình thanh trùng, MT dễ bị cháy khét và bị vón, làm cho vi sinh vật khó đồng hóa, cám sẽ kết dính lại tạo khối chặt ngăn chặn xâm nhập của không khí vào MT.