3. Kết quả xác định thời gian kết tủa enzyme thích hợp
3.4. XUẤT QUY TRÌNH NUÔI CẤY ASP.NIGER SINH PECTINASE
TRÊN MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN LÀ BÃ THẢI CÀ RỐT
Từ kết quả trên cho phép đề xuất quy trình nuôi cấy Asp.niger sinh pectinase như sau:
Sơđồ quy trình:
Diễn giải quy trình:
− Chuẩn bị môi trường:
Tỷ lệ các thành phần môi trường theo kết quả nghiên cứu trên đây, gồm cám gạo 52.63%, trấu 10.53%, bã cà rốt 36.84%, (NH4)2SO4 3% (theo KLMTTN). Do các thành phần trên tính theo KLMTTN, nên tùy thuộc độ ẩm MT ban đầu để tính quy đổi ra khối lượng thực tế của từng thành phần. Chọn cám gạo chất lượng tốt, không mùi ôi khét, không mốc, hàm lượng tinh bột không dưới 20%; bã cà rốt không mốc, không mùi chua, không biến màu; (NH4)2SO4 không vón cục. Các thành phần trên (sau khi tính toán theo yêu cầu) thì trộn đều. Sau đó làm ẩm môi trường bằng nước cất đểđạt độẩm 56%.
Lượng nước cần thiết thêm vào được xác định theo công thức sau:
44 56 . ) 56 100 ( 56 . G G N = − =
Chuẩn bị môi trường
Thanh trùng ở 1210C/15 phút
Nuôi mốc trên khay ở nhiệt độ
320C, độẩm 56%, 35h Cấy mốc giống Thu nhận và bảo quản Mốc giống Asp.niger Nhân giống Bã cà rốt Cám Trấu (NH4)2SO4
Với:
N: lượng nước cần cho vào (l)
G: khối lượng môi trường khô tuyệt đối (kg)
− Thanh trùng môi trường:
Mục đích để làm chín môi trường, chuyển hóa các chất dinh dưỡng từ
dạng phức tạp sang dạng đơn giản dễ hấp phụ. Đồng thời còn tiêu diệt các vi sinh vật tạp nhiễm trong môi trường nuôi cấy. Thanh trùng môi trường bằng hơi nước
ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút.
− Làm nguội môi trường:
Sau khi thanh trùng, làm nguội môi trường trong phòng vô trùng đến nhiệt
độ 320C, làm tơi và trải đều lên khay men thành mỏng với bề dày lớp môi trường khoảng 3 - 5cm.
− Chuẩn bị mốc giống:
Trộn cám, bã cà rốt, trấu với nước với tỷ lệ 1/1/0.05/0.2 đểđảm bảo độẩm khoảng 58%. Chuẩn bị ba bình tam giác 250ml, cho 100g môi trường như trên đi hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút và để nguội. Sau đó, chuyển toàn bộ bào tử từ ống giống gốc bằng cách cho vào mỗi ống nghiệm 10ml nước vô trùng và khuấy đều cho bào tử giống trong ống nghiệm hòa trộn trong nước. Chuyển toàn bộ sang các bình tam giác đã chuẩn bị sẵn, lắc đều cho môi trường trộn đều bào tử. Nuôi ở nhiệt độ 30 - 370C trong 3 ngày, khi thấy trong bình tam giác toàn bào tửđen thì dừng nuôi.
Tiếp đó, chuẩn bị sẵn môi trường như trên, thanh trùng môi trường và chuyển chúng vào các khay nhôm hoặc inox và tãi đều môi trường sau khi cho 10% giống từ bình tam giác đã nuôi ở trên vào, bề dày MT sau trộn giống 3 - 5cm. Để khay trong phòng có nhiệt độổn định 320C trong 3 - 4 ngày khi bào tử đen xuất hiện kín bề mặt môi trường. Sau đó, sấy môi trường ở nhiệt độ 390C trong 8h và thu được bào tử giống sẵn sàng cho sản xuất đại trà.
− Nuôi mốc trên khay:
Trộn đều mốc giống và môi trường với tỷ lệ 0.5% (so với KLMTTN) thì ủ
thành đống, để tạo điều kiện thuận lợi cho bào tử nảy mầm, thời gian ủ từ 5 - 8h. Sau đó trải đều môi trường đã cấy mốc thành lớp dày từ 3 - 5cm trên khay men sạch và đặt vào phòng nuôi cấy có sẵn các giá đỡ. Lúc này cần thông khí tốt cho môi trường để tạo điều kiện cho mốc phát triển trong giai đoạn đầu. Sau thời gian từ 10 - 12h, mốc sẽ phát triển thành hệ sợi, làm cho môi trường kết bánh lại. Do vậy, cần đảo trộn và thông khí thường xuyên vì ở giai đoạn này mốc phát triển mạnh, tỏa nhiệt làm tăng nhiệt độ môi trường và giảm độ ẩm. Ta cần thông khí và phun nước dưới dạng sương vào phòng nuôi để đảm bảo nhiệt độ ổn định ở
mức 320C, độẩm môi trường ở mức 56%. Thời gian nuôi mốc là 35h, khi đó bắt
đầu xuất hiện bào tử có màu đen cà phê. Để tránh vi sinh vật nhiễm tạp trong quá trình nuôi cấy thì các dụng cụ phải sạch sẽ, trước mỗi lần sử dụng phải tiệt trùng. Phòng nuôi cấy phải sạch, sau mỗi chu kỳ nuôi cấy phải được chiếu tia cực tím
để tiệt trùng. Trong quá trình nuôi cấy phải thường xuyên kiểm tra, nếu thấy xuất hiện mốc lạ (có màu đỏ, vàng, …) thì phải loại bỏ phần đó đi.
− Thu nhận và bảo quản môi trường chứa enzyme:
Kết thúc thời gian nuôi cấy độẩm của môi trường thường từ 35% - 40%,
để bảo quản cần phải làm tơi và sấy khô. Để tránh mất hoạt tính pectinase thì sấy chân không với PCK = 0.8±0.05at, nhiệt độ 390C, thời gian 8h, đến khi độ ẩm môi trường đạt từ 10 - 15%. Làm nguội, nghiền nhỏ và đóng gói trong túi polyetylen (PE), hoặc giấy chống ẩm kín bảo quản ở nhiệt độ 50C - 100C, thời gian bảo quản không quá ba tháng. Sản phẩm này gọi là chế phẩm pectinase thô (CP thô) có thể sử dụng trực tiếp hoặc dùng làm nguyên liệu để tách chiết ra chế
phẩm pectinase kỹ thuật hay tinh khiết.
So với chế phẩm pectinase thô của Lê Văn Nhương (ĐHBK Hà Nội) thì CP nghiên cứu có hoạt tính khá cao: CP nghiên cứu là 1.25 HđPE/1g CP thô (xác
theo hoạt độ PG bằng phương pháp so màu), 1820 HđPG/g canh trường (xác
định theo độ nhớt)
Sơ bộ tính được chi phí cho 1kg CP pectinase thô (hoạt độ 1.25 HđPE/1g CP thô) của Asp.niger trong thí nghiệm là 11851 đồng (9.481 đồng/1 đơn vị hoạt
động).