Sau khi lựa chọn acetone làm dung môi kết tủa dịch chiết enzyme pectinase, tiến hành xác định tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme. Vì ứng với mỗi tỷ
lệ acetone/dịch chiết enzyme nhất định thì khả năng kết tủa enzyme cũng như
mức độảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme khác nhau.
Cốđịnh các thông số: các thông số trong quá trình chiết, thời gian kết tủa là 30 phút và cho thay đổi tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme. Tiến hành xác định hoạt độ pectinase và chọn tỷ lệ dung môi kết tủa thích hợp. Kết quả thí nghiệm
được thể hiện trên hình 3.9. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1.5/1 2.0/1 2.5/1 3.0/1 3.5/1 4.0/1 5.0/1
Tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme
H ( H đ P E /g C P K T )
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme đến hoạt độ
pectinase trong quá trình kết tủa pectinase
Từ biểu đồ cho thấy: càng tăng lượng acetone lên (trong khoảng thí nghiệm) thì hoạt độ pectinase càng tăng (tăng 29.31% ở giá trị 2/1 so với giá trị
1.5/1) và đạt cực đại tại giá trị 2.5/1 (46.354 - tăng 53.45% so với giá trị 1.5/1). Acetone sẽ lấy nước của phân tử enzyme, làm giảm hằng sốđiện môi của chúng từ đó làm kết tủa enzyme pectinase. Khi tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme còn ít không đủ để kết tủa hết lượng pectinase có trong dịch chiết nên lượng pectinase kết tủa thu được ít, hoạt độ pectinase thấp. Khi tăng lượng acetone lên thì lượng enzyme pectinase tiếp xúc với tác nhân kết tủa (acetone) lớn, lượng pectinase
được kết tủa triệt để hơn, hoạt độ cao hơn. Tại giá trị 2.5/1 thì lượng pectinase có trong dịch chiết và acetone được tiếp xúc tối đa và vừa đủ nên hoạt độ tại giá trị
này cũng cao nhất (46.354). Tuy nhiên, nếu càng tăng tỷ lệ acetone lên thì hoạt
độ pectinase lại giảm (giảm lần lượt 22.47%, 68.54% ở giá trị 3/1 và 3.5/1 so với giá trị cực đại). Điều này có thể do khi đã kết tủa hết lượng pectinase có trong dịch chiết mà vẫn tiếp tục cho acetone vào thì có thể dung môi này gây mất nước mạnh đối với protein - enzyme làm biến tính không thuận nghịch enzyme từ đó làm giảm hoạt độ pectinase nhưng đồng thời cũng tiêu tốn lượng acetone lớn hơn, tăng thêm chi phí. Ở các tỷ lệ 4/1 và 5/1 thì hoạt độ pectinase không thể
giảm hơn được nữa (68.54% so với giá trị cực đại) có thể là do acetone đã tác
động hết các gốc ưa nước của protein - enzyme gây biến tính không thuận nghịch tới protein - enzyme nên dù cho lượng acetone lớn mà hoạt độ pectinase không giảm hơn được nữa.
Vì thế, chọn tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme là 2.5/1.