3. Kết quả xác định thời gian kết tủa enzyme thích hợp
3.5.XUẤT QUY TRÌNH THU NHẬN CHẾ PHẨM PECTINASE KỸ
THUẬT TỪ CANH TRƯỜNG THÔ CỦA ASP.NIGER
Từ kết quả nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất quy trình thu nhận chế
phẩm pectinase kỹ thuật như sau: Sơđồ quy trình:
Thuyết minh quy trình:
− Chế phẩm pectinase thô của nấm mốc đưa vào chiết rút có độ ẩm 10 – 15% phải được nghiền tơi để tạo điều kiện cho pectinase dễ hòa tan vào nước cất.
Chế phẩm pectinase thô của nấm mốc Chiết pectinase Ly tâm, lọc Dịch chiết chứa pectinase Kết tủa pectinase từ dịch chiết Nước Acetone Bã
Sấy chân không kết tủa thu được ở 390C
Bảo quản ở nhiệt độ 5 - 100C Ly tâm, lọc
− Tiến hành chiết pectinase bằng nước cất, tỷ lệ nước cất/CP thô 3/1, thời gian chiết là 50 phút. Khuấy đều, chiết rút enzyme trong vòng 50 phút ở nhiệt độ
phòng.
− Sau khi chiết rút xong tiến hành lọc, ly tâm lạnh với vận tốc góc ω = 3000 vòng/phút, thời gian 15 phút, thu dịch trong, làm lạnh và bảo quản ở 40C.
− Kết tủa pectinase từ dịch chiết: dùng dung môi acetone có nhiệt độ 40C để
kết tủa pectinase từ dịch chiết. Tỷ lệ acetone/dich chiết enzyme là 2.5/1, khuấy
đều giữ ở nhiệt độ 40C trong vòng 15 phút. Sau đó đem ly tâm lạnh với vận tốc góc ω = 3000 vòng/phút, thời gian 15 phút, thu kết tủa.
− Lượng kết tủa thu được đem sấy trong tủ sấy chân không, ở nhiệt độ 390C, với áp suất chân không PCK = 0.8 ± 0.05 at, thời gian là 8h. Chế phẩm sau khi sấy khô đến độẩm 8 – 10% đem nghiền nhỏ, được gọi là chế phẩm pectinase kỹ
thuật. Chế phẩm được bao gói trong bao PE, đẩy hết không khí ra khỏi bao, hàn kín miệng, rồi đem bảo quản ở nhiệt độ 50C – 100C trong vòng 10 – 12 tháng.
− Sơ bộ tính được chi phí để làm ra 1kg CP pectinase kỹ thuật (có hoạt độ
56.25 HđPE/g CP KT) của chủng Asp.niger trong thí nghiệm là 6026647 đồng (tương đương 107.14 đồng/1 đơn vị hoạt động). So với chi phí để sản xuất ra 1
đơn vị hoạt độ pectinase ở dạng thô (9.481 đồng/1 đơn vị hoạt động) thì chi phí ở đây gấp 11.3 lần. Tuy nhiên việc sử dụng và bảo quản chế phẩm kỹ thuật lại thuận lợi hơn rất nhiều, đặc biệt là hạn chế được những ảnh hưởng xấu của các tạp chất của môi trường nuôi cấy còn lại trong CP thô.
− So với các chế phẩm pectinase kỹ thuật thì hoạt tính của CP thu được còn thấp: polygalacturonase (1982, 3314, 1878), polymetylgalacturonase (43, 53, 74), pectinesterase (548, 448, 227) (theo hoạt tính riêng của các phức hợp đa enzyme của ba chế phẩm thương mại khác nhau).
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên cho phép rút ra kết luận sau:
1. Đã xác định được thành phần môi trường nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp pectinase từ chủng Asp.niger trong điều kiện phòng thí nghiệm gồm: độ ẩm môi trường ban đầu 56%, hàm lượng cám 52.63% (theo KLMTTN), hàm lượng (NH4)2SO4 3% (theo KLMTTN).
2. Đã xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu: nhiệt độ môi trường 320C, thời gian nuôi cấy 35h, tỷ lệ giống 0.5% (theo KLMTTN).
3. Đã xác định được điều kiện tách chiết pectinase thích hợp gồm: nước cất là dung môi chiết enzyme pectinase, tỷ lệ nước cất/CP thô là 3/1, thời gian chiết là 50 phút, acetone là dung môi kết tủa enzyme pectinase, tỷ lệ
acetone/dịch chiết enzyme là 2.5/1, thời gian kết tủa là 15 phút.
4. Đã đề xuất quy trình nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme pectinase từ
Asp.niger và quy trình thu nhận enzyme này. Đạt hoạt độ chế phẩm thô là 1.25 HđPE/1g CP thô, hoạt độ chế phẩm enzyme kỹ thuật là 56.25 HđPE/g CP KT.
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
1. Cần quan tâm nghiên cứu hơn nữa tới các đối tượng vi sinh vật khác nhau trên các đối tượng môi trường khác nhau để sản xuất các enzyme khác nhau. Đồng thời, đưa chúng vào sản xuất đại trà và ứng dụng trong thực tế. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Nghiên cứu thêm chế độ thông gió và khuấy đảo trong quá trình nuôi cấy
Asp.niger trên môi trường rắn.
3. Đưa chế phẩm pectinase sản xuất được ứng dụng vào trong các quá trình như làm trong nước quả, xử lý bã thải cà rốt từ các nhà máy đồ hộp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme protease từ B.subtilis S5, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục.
4. Trần Liên Hà (2007), Đại cương vi sinh vật thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.
5. Đặng Văn Hợp (2000), Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất protease từ Asperigillus oryzae A4 và ứng dụng vào sản xuất nước mắm, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Nha Trang.
6. Đặng Văn Hợp và các tác giả khác (2006), Phân tích kiểm nghiệp thực phẩm thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
7. Nguyễn Đức Lượng (2000), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Đức Lượng (2001), Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh vật tập 2: Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
10.Nguyễn Đức Lượng, Lê Thanh Mai, Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho Asp.niger phân giải cellulose trong phế liệu dứa, Tạp chí Khoa học công nghệ số 1 (12) – 2008.
11.Lê Thanh Mai và các tác giả khác (2005), Các phương pháp phân tích trong công nghệ lên men, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.
12.Lê Văn Nhương, Đặng Hạnh Khôi, Hoàng Tuyết Minh (1978), Thu nhận và ứng dụng các chất hoạt động sinh học từ vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.
13.Đỗ Văn Ninh (2004), Nghiên cứu quy trình thủy phân protein bằng protease nội tạng cá, mực và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ
protein thực phẩm, Luận án Tiến sĩ, Đại học Nha Trang.
14.Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, Nhà xuất bản Giáo dục. 15.Đặng Trung Thành (2008), Nghiên cứu chiết rút chitinase từ lá khoai
lang và bước đầu thử nghiệm thủy phân chitin để sản xuất olygo-chitin, Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật, Đại học Nha Trang.
16.Phạm Hồng Ngọc Thùy (2008), Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế
phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus, Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật, Đại học Nha Trang.
Tài liệu tiếng Anh
17.E.A. Abu, S.A. Ado and D. B. James, Raw starch degrading amylase production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on sorghum pomace,African Journal of Biotechnology Vol. 4 (8), pp. 785-790, August 2005.
18.Maria F. S. Teixeira, José L. Lima Filho, Nelson Durán, Carbon sources effect on pectinase production from Aspergillus japonicus 586, Braz. J. Microbiol. vol.31 no.4 São Paulo Oct./Dec. 2000.
19.Urmila Phutela, Vikram Dhuna, Shobhna Sandhu, B.S. Chadha,
Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels, Braz. J. Microbiol. vol.36 no.1 São Paulo Jan/Mar. 2005
Từ trang Web 20.http://creativecommons.org 21.https://fungalgenomics.concordia.ca/fungi/Anig.php#desc 22.http://freepatentsonline.com 23.http://genome.jgi-psf.org 24.http://gralib.hcmuns.edu.vn 25.http://hoahocdoisong.com 26.http://rauhoaquavietnam.com.vn 27.http://scielo.br
PHỤ LỤC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của độẩm môi trường ban đầu tới khả năng sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger
Độẩm (%) 50 52 54 56 58 60 H (HđPE/g CP thô) 0.583 0.625 0.646 0.656 0.604 0.542
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng cám tới khả năng sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger Hàm lượng cám (theo KLMTTN) 43.75 47.06 50 52.63 55 57.14 59.09 60.87 62.5 64 65.38 66.67 H (HđPE/g CP) 0.51 0.526 0.578 0.656 0.646 0.615 0.552 0.542 0.521 0.516 0.51 0.505
Bảng 3.3a. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Asp.niger trên môi trường nuôi cấy tới khả
năng sinh tổng hợp pectinesterase của Asp.niger
Tỷ lệ giống (%) 0.2 0.5 0.7 1 2 5 7 10 H (HđPE/g CP KT) 0.604 0.739 0.713 0.677 0.635 0.604 0.531 0.5
Bảng 3.3b. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Asp.niger trên môi trường nuôi cấy tới khả
năng sinh tổng hợp polygalacturonase của Asp.niger
Tỷ lệ giống (%) 0.2 0.5 0.7 1 2 5 7 10 Tỷ lệ giảm độ nhớt (%) 89.01 95.37 95.06 93.52 92.59 91.67 91.97 91.67
Bảng 3.4a. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 tới khả năng sinh tổng hợp polygalacturonase của Asp.niger Hàm lượng (NH4)2SO4 (%) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Tỷ lệ giảm độ nhớt (%) 95.3 7 95.3 7 95.3 7 95.3 7 95.6 8 96.3 97.5 3 95.6 8 95.6 8
Bảng 3.4b. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 tới khả năng sinh tổng hợp pectinesterase của Asp.niger Hàm lượng (NH4)2SO4 (%) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Tỷ lệ tăng HđPE (%) 0 0 0 1.49 2.9 16.2 9 22.6 3 11.3 5 7.13
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường tới khả năng sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger
Nhiệt độ (oC) 28 30 32 34 36 38 40 H (HđPE/g CP thô) 0.833 0.875 0.958 0.865 0.823 0.75 0.708
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger Thời gian (h) 28 30 32 34 35 36 37 38 39 40 46 H (HđPE/g CP thô) 0.911 0.937 0.958 1.083 1.25 1.042 0.979 0.938 0.922 0.885 0.875
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau tới hoạt độ pectinase trong quá trình chiết pectinase
Dịch chiết enzyme Nước cất Dung dịch đệm pH=6.5 Dung dịch NaCl 1%
H (HđPE) 0.833 0.69 0.664
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước cất/CP thô tới hoạt độ pectinase trong quá trình chiết pectinase
Tỷ lệ nước cất/CP thô 2.0/1 3.0/1 4.0/1 5.0/1 6.0/1 H (HđEP/ml dịch chiết) 0.75 1.042 0.875 0.872 0.87
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt độ pectinase trong quá trình chiết pectinase
Thời gian chiết (phút) 20 30 40 50 60 70 80 H (HđPE/g CP thô) 0.661 0.714 0.943 1.164 1.042 0.786 0.74
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau tới hoạt độ pectinase trong quá trình kết tủa pectinase
Loại dung môi Ethanol 960 Acetone (NH4)2SO4
Lượng enzyme thu được (g/100ml dịch chiết) 1.25 1.125 0.810 H (HđPE/g chế phẩm) 31.25 35.938 29.688 Hoạt độ tương đối so với trước khi kết tủa (%) 65.79% 68.09% 40.50%
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ acetone/dịch chiết enzyme đến hoạt độ
pectinase trong quá trình kết tủa pectinase Tỷ lệ acetone/dịch
chiết enzyme 1.5/1 2.0/1 2.5/1 3.0/1 3.5/1 4.0/1 5.0/1 H
(HđPE/g CP thô) 30.208 39.063 46.354 35.938 14.583 14.583 14.583 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ pectinase trong quá trình
kết tủa pectinase Thời gian kết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tủa (phút) 5 10 15 20 25 30 35 40 H (HđPE/g
PHỤ LỤC 2: XÁC ĐỊNH CÁC THÀNH PHẦN
1. Xác định hàm lượng nước hay độẩm của nguyên liệu [6] Sử dụng phương pháp sấy ở nhiệt độ cao
a. Nguyên lý
Dùng nhiệt độ cao để làm bay hơi hết nước trong mẫu thử, sau đó dựa vào hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy sẽ tính được hàm lượng nước trong thực phẩm.
b. Dụng cụ, hóa chất − Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ − Cân phân tích, độ chính xác 10-4g − Cốc sấy có nắp đậy (bằng sứ hoặc thủy tinh) − Đũa thủy tinh − Bình hút ẩm có chứa silicagen − Cối, chày và các dụng cụđể cắt mẫu c. Tiến hành Tiến hành sấy ở nhiệt độ 100 – 1050C
Sấy cốc sấy tới khối lượng không đổi: cốc được rửa sạch, úp khô, sấy ở
nhiệt độ 100 – 1050C trong khoảng 1h, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm → cân
→ sấy tiếp ở nhiệt độ trên → làm nguội trong bình hút ẩm → cân → sấy đến khi nào giữa 2 lần liên tiếp khác không quá 5.10-4g (gọi thao tác này là sấy đến khối lượng không đổi – chứng tỏ mẫu vật đem sấy đã khô hoàn toàn).
Cân chính xác 5 – 10g mẫu (đã được chuẩn bị) trong cốc đã sấy khô đến khối lượng không đổi. Đánh tơi mẫu bằng đũa thủy tinh, dàn đều mẫu trên đáy cốc. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở 60 – 800C trong 2h. Sau đó nâng nhiệt độ lên 100 – 1050C, sấy liên tục trong 3h. Chú ý trong quá trình sấy cứ sau 1h đảo mẫu 1 lần.
Lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm → cân trên cân phân tích → sấy tiếp ở nhiệt độ 100 – 1050C đến khối lượng không đổi như trên.
d. Kết quả
Độẩm (hàm lượng nước) của thực phẩm được tính theo công thức sau:
(%) 100 1 2 1 2O = GG−−GG ∗ H X Trong đó:
− XH2O: độẩm (hàm lượng nước) của thực phẩm (%)
− G1: khối lược cốc sấy và mẫu thử trước sấy (g)
− G2: khối lược cốc sấy và mẫu thử sau sấy (g)
− G: khối lượng cốc sấy (g) 2. Xác định hàm lượng tro toàn phần [6]
Xác định tro toàn phần theo phương pháp nung ở nhiệt độ cao (550 – 6000C)
a. Nguyên lý
Dùng sức nóng (550 – 6000C) nung cháy hoàn toàn các chất hữa cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra hàm lượng tro toàn phần trong thực phẩm.
b. Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử
− Chén nung bằng sứ, hoặc bằng kim loại (bạch kim)
− Đèn cồn hay bếp điện
− Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ (đến 550 – 6000C)
− Cân phân tích
− Bình hút ẩm, phía dưới để chất hút ẩm
− H2O2 10 thể tích hoặc HNO3đậm đặc c. Tiến hành
Nung chén sứ hoặc chén kim loại đã rửa sạch ở lò nung tới 550 – 6000C
đến trọng lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác đến 10-4g. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho vào chén khoảng 5g chất thử. Cân tất cảở cân phân tích, với độ chính xác như trên. Cho tất cả vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ đến 550 – 6000C.
Nung cho đến tro trắng nghĩa là đã loại hết các chất hữu cơ, thông thường khoảng 6 – 7h.
Trong trường hợp còn tro đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 10 thể tích hoặc HNO3 đậm đặc và nung lại cho đến tro trắng. Để nguội trong bình hút ẩm và cân với độ chính xác như trên. Tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân, lặp đi lặp lại thao tác này cho tới trọng lượng không đổi. Kết quả giữa 2 lần nung và cân liên tiếp không được cách nhau quá 0.0005g.
d. Kết quả
Hàm lượng tro tính theo %. (X1) tính bằng công thức:
(%) 1 2 1 G G G G X − − = Trong đó: −G1: khối lượng chén nung và mẫu (g) −G: khối lượng chén nung (g)
−G2: khối lượng chén nung và tro trắng (g) 3. Xác định nitơ tổng số theo phương pháp kjeldahl [6]
a. Nguyên lý
Để xác định đạm tổng quát trong thực phẩm người ta dùng H2SO4 đậm
đặc và chất xúc tác đặc biệt là hỗn hợp CuSO4 và K2SO4 theo tỷ lệ 1/10 để vô cơ
hóa; mục đích để chuyển toàn bộ nitơ trong thực phẩm về dạng muối (NH4)2SO4. Sau đó dùng NaOH đặc đẩy NH3 ra và dùng hơi nước lôi cuốn NH3 ra khỏi thiết bị chưng cất vào cốc hứng chứa H2SO4 0.1N dư, cuối cùng dùng NaOH 0.1N chuẩn độ lại H2SO4 dư. Các phản ứng xảy ra như sau: R1-CH-CO-NH-CH-R2 + H2SO4→ (NH4)2SO4 + CO2 + H2O + SO2 COOH NH3 (NH4)2SO4 + 2NaOHđặc → Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
NaOH + H2SO4 dư → Na2SO4 + 2H2O b. Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử
− Dụng cụ vật liệu thông thường của phòng thí nghiệm
− Bình kjeldahl
− H2SO4đậm đặc (D = 1.84)
− Các chất xúc tác như CuSO4/K2SO4 = 3.5/50
− NaOH 50% (D = 1.33) (không chứa carbonate)
− Chỉ thị màu
Methyl đỏ : 0.1g Cồn 950 vừa đủ: 100ml
− Hòa tan ở nồi cách thủy sôi
− H2SO4 0.1N hoặc HCl 0.1N c. Tiến hành
− Lấy chính xác 1g mẫu cho cẩn thận vào bình kjeldahl, thêm 2g hỗn hợp chất xúc tác CuSO4/K2SO4 và 10ml H2SO4 đậm đặc để nghiêng trên bếp đun từ
từ. Trong quá trình vô cơ màu sắc của mẫu chuyển từ màu nâu đen sang màu vàng rồi xanh trong hoặc không màu là được.
− Rửa thiết bị chưng cất: tiến hành sục rửa thiết bị chưng cất và kiểm tra các khớp nối phải đảm bảo độ kín.