Nguyên vật liệu - Đánh giá ảnh hưởng của dịch bact- 123docz.net

2.1.1. Mẫu cá giị

Cá giị tươi được thu mua ở đìa nuơi ở Lương Sơn – Nha Trang – Khánh Hịa. Sử dụng 4 mẫu cá cho một lần thí nghiệm. Lặp lại thí nghiệm hai lần.

Bảng 2.1. Các mẫu cá giị dùng để đánh giá ảnh hưởng của dịch bacteriocin

Nhiệt độ Mẫu nhúng dịch bacteriocin Mẫu đối chứng

0 - 4oC 1 con 1 con

30oC 1 con 1 con

2.1.2. Chủng vi khuẩn lactic T8

Chủng vi khuẩn lactic T8 được lấy từ bộ sưu tập các chủng vi sinh vật lấy từ phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang. Chủng vi khuẩn này được bảo quản trong glycerol 30% ở nhiệt độ -70oC. Chủng vi khuẩn lactic T8 được nuơi cấy trên mơi trường MRS (De Man, Rogosa, Sharpe ), ở 37oC, pH 6,2 - 6,8.

2.1.3. Hĩa chất

a) Mơi trường MRS để nuơi cấy vi khuẩn lactic

Thành phần (/l)  Pepton : 10 g  Cao nấm men : 5 g  Glucose : 20 g  Tween 80 : 1 ml  CH3COONa : 5 g  MgSO4.7H2O : 0,2 g  MnSO4.H2O : 0,05 g  KH2PO4 : 2 g  (NH4)2SO4 (SA) : 2 g  Nước cất thêm đủ : 1000 ml

Hịa tan các thành phần của mơi trường trong nước cất rồi điều chỉnh pH tới 6,2 - 6,8. Khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 10 phút.

b) Mơi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar) để nuơi cấy

Vibrio

Pepton : 10 g Cao nấm men : 5 g

Natri citrat : 10 g Natri thiosulfat (Na2S2O3) : 10 g

Mật bị : 5 g Sucrose : 20 g

NaCl : 10 g Sắt (III) citrate (FeC6H5O7) : 1 g

Natri cholate : 3 g Xanh bromthymol : 0,04 g

Xanh thymol : 0,04 g Thạch : 15 g

Nước cất vơ trùng : 1 lít pH : 8,6 - 0.2

Đun sơi mơi trường trong bình tam giác ở 100oC trong lị vi sĩng cho đến khi tan hồn tồn các thành phần mơi trường.

c) Mơi trường RV (Rappaport Vassiliadis) để nuơi cấy Salmonella

 Mơi trường cơ bản:

Tryptone : 5 g

NaCl : 8 g

KH2PO4 : 1,6 g

Nước cất : 1000 ml

 Dung dịch Magnesium chloride:

MgCl2.6H2O : 400 g

Nước cất : 1000 ml

 Dung dịch Malachite green oxalate:

Malachite green oxalate : 0,4 g

Nước cất : 100 ml

 Mơi trường hoàn chỉnh:

Mơi trường cơ bản : 1000 ml

Dung dịch MgCl2 : 100 ml

Tổng thể tích : 1110 ml

pH : 5,50,2

Agar : 15 - 20 g/1000 ml

d) Mơi trường TSB (Trypton Soy Broth) để hoạt hĩa Vibrio

Trypticase peptone : 17 g Phytone peptone : 3 g NaCl : 5 g K2HPO4 : 2,5 g Glucose : 2,5 g Nước cất : 1000 ml

e) Nước muối sinh lý

Hịa tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút rồi để nguội.

f) Hĩa chất xác định hàm lượng protein tổng số

 Nước cất 01 lần

 Acid sunfuric đậm đặc

 Hỗn hợp K2SO4 và CuSO4.5H2O

Xúc tác gồm hỗn hợp K2SO4 và CuSO4 được cân theo tỷ lệ 1:5 trộn đều.

 NaOH 40%

Hịa tan 400 g NaOH trong nước và định mức thành 1000 ml.  H3BO3 4%

Hịa tan 40 g H3BO3 trong nước và định mức thành 1000 ml.  Chỉ thị TaShiro

Hịa tan 2 g methyl đỏ và 1 g methyl xanh trong ethanol và định mức thành 1000 ml.

 Ethanol 95%

Pha 950 ml ethanol trong nước và định mức thành 1000 ml.  Acid HCl 0,1N

 Nước cất  MgO  H2SO4 0,1N  NaOH 0,1N  Chỉ thị màu phenolphthalein  Chỉ thị màu methyl đỏ

2.1.4. Thiết bị chuyên dụng

 Cân phân tích BL-3200H (L) (Shimadzu, Nhật Bản)  Máy dập mẫu Smasher (Việt Nam)

 Máy ly tâm lạnh ống nhỏ (Mega 17R)

 Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co., Ltd, Tây Ban Nha)  Tủ sấy (Binder, Đức)

 Nồi khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co., Ltd, Đài Loan)  Lị vi sĩng (LG, Hàn Quốc)

 Máy lắc (GFL 3005, Đức)

 Tủ ấm Binder BF115 (Binder, Đức)  Thiết bị chưng cất đạm (Gerhardt, Đức)  Máy đo lưu biến (CR-500DX)

2.2.Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thu nhận dịch bacteriocin thơ từ chủng vi khuẩn lactic T8

 Các bước tiến hành

 Hoạt hĩa chủng vi khuẩn lactic T8

 Thao tác được thực hiện trong tủ cấy vơ trùng, mơi trường vơ trùng, các dụng cụ đã sấy tiệt trùng ở 160oC/120 phút và các thao tác vi sinh làm bên cạnh ngọn lửa đèn cồn.

 Lấy ống giống vi khuẩn lactic T8 ra khỏi tủ đơng sâu để cho tan giá rồi đưa lên máy vortex để trộn đều.

 Hút dịch vi khuẩn lactic T8 vào bình tam giác cĩ chứa sẵn mơi trường MRS theo tỷ lệ 1:9. Đặt bình tam giác vào máy lắc với thơng số 180 vịng/phút trong 18 - 20 giờ. Ta được dịch hoạt hĩa lần 1.

 Tiến hành hoạt hĩa lần 2 tương tự như lần 1. Ta lấy dịch hoạt hĩa chủng vi khuẩn lactic T8 lần 1 chuyển sang bình tam giác cĩ chứa sẵn mơi trường MRS theo tỷ lệ 1:9. Sau đĩ lại đặt bình tam giác lên máy lắc được cài đặt thơng số 180 vịng/phút trong 18 - 20 giờ. Ta được dịch hoạt hĩa lần 2.

 Thu nhận dịch bacteriocin thơ từ chủng vi khuẩn lactic T8.

 Sau khi thu được dịch hoạt hĩa lần 2 của chủng vi khuẩn lactic T8 ta tiến hành ly tâm dịch cấy ở 4oC với tốc độ 7000 vịng/ phút trong 10 phút.

 Thu nhận dịch, loại bỏ sinh khối lắng bên dưới, ta thu được dịch bacteriocin thơ từ chủng vi khuẩn lactic T8.

2.2.2. Đánh giá cảm quan

Đánh giá cảm quan là kỹ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để nhận biết, mơ tả và định lượng các tính chất cảm quan của một sản phẩm như màu sắc, hình thái, mùi, vị và cấu trúc.

Để đánh giá chất lượng cá giị, chúng tơi sử dụng phương pháp cho điểm được quy định theo Tiêu chuẩn Việt Nam – TCVN (3215 - 79). Tiêu chuẩn này sử dụng hệ 20 điểm xây dựng trên một thang thống nhất cĩ 6 bậc (từ 0 đến 5) trong đĩ điểm 0 ứng với chất lượng sản phẩm “bị hỏng”, cịn từ điểm 1 đến điểm 5 ứng với mức khuyết tật giảm dần. Ở điểm 5 sản phẩm coi như khơng cĩ sai lỗi và khuyết tật nào, trong tính chất đang xét, sản phẩm cĩ tính tốt đặc trưng và rõ rệt cho chỉ tiêu đĩ. Tổng hệ số trọng lượng của tất cả các chỉ tiêu được đánh giá cho một sản phẩm bằng 4.

Khi đánh giá mỗi kiểm nghiệm viên căn cứ kết quả ghi nhận được, đối chiếu với bảng mơ tả các chỉ tiêu này (bảng bày được xây dựng cụ thể cho từng loại sản phẩm) và dùng số nguyên để cho điểm từ 0 tới 5. Nếu cĩ nhiều kiểm nghiệm viên cùng tham gia đánh giá (n), thì điểm trung bình cộng của (n) kiểm nghiệm viên, lấy chính xác đến 2 chữ số thập phân sau dấu phẩy. Để đánh giá cảm quan cho nguyên

liệu cá giị tươi thì trước tiên tiến hành xây dựng thang điểm cho từng chỉ tiêu: màu, mùi, trạng thái. Thang điểm đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của cá giị nguyên liệu được trình bày ở bảng 2.3, 2.4 và 2.5. Bảng 2.2. Các mức chất lượng Mức Điểm Mức Điểm Tốt 18,620,0 Kém 7,211,1 Khá 15,218,5 Rất kém 4,07,1 Trung bình 11,215,1 Hỏng 0,03,9

Bảng 2.3. Thang điểm chỉ tiêu màu của cá giị nguyên liệu

Cách đánh giá Yêu cầu Điểm

Bề mặt da cá cĩ màu đen bĩng, sáng; giác mạc trong suốt, đồng tử đen,sáng; mang màu đỏ tươi; thịt cá cĩ màu hồng nhạt, trong

Bề mặt da cá đen nhưng kém sáng; giác mạc trong, đồng tử đen; mang cĩ màu đỏ; thịt cá màu hồng nhạt, hơi đục

Bề mặt da cá hơi nhạt màu; giác mạc hơi đục, đồng tử đen, mờ; mang cĩ màu đỏ thẫm; thịt màu hồng nhạt, đục

Bề mặt da cá nhạt màu, dần chuyển sang nâu; giác mạc đục, đồng tử mờ đục; mang cĩ màu đỏ nâu; thịt mất màu hồng chuyển sang màu trắng xám, đục

2 Kiểm nghiệm viên đánh

giá tổng quan trên tồn bộ bề mặt cá, da, mắt, mang, thịt cá, ghi nhận và cho điểm

Bề mặt da cá chuyển sang màu nâu; giác mạc đục, đồng tử mờ đục; mang cĩ màu nâu; thịt dần chuyển sang màu xám, rất đục

Bề mặt da cá chuyển sang màu xám; giác mạc rất đục, đồng tử xám xịt; mang cĩ màu hơi vàng; thịt cĩ màu xám nâu, rất đục

Bảng 2.4. Thang điểm chỉ tiêu mùi của cá giị nguyên liệu

Cách đánh giá Yêu cầu Điểm

Tươi, cĩ mùi rong biển, kim loại 5

Mùi trung tính (khơng mùi) 4

Mùi hơi, hơi cĩ mùi hơi dầu 3

Mùi chua, mùi ơi, mùi hơi dầu 2

Mùi ơi, mùi khai, mùi trứng thối 1 Tiến hành thử bằng

cách cắt cá giị thành từng miếng mỏng rồi quan sát. Kiểm nghiệm viên ghi nhận và cho điểm.

Mùi ươn hỏng 0

Bảng 2.5. Thang điểm chỉ tiêu trạng thái của cá giị nguyên liệu

Cách đánh giá Yêu cầu Điểm

Kết cấu cơ thể mềm, đàn hồi tốt, cĩ thể bắt đầu xuất hiện giai đoạn cứng cơ

Kết cấu cơ thể rất cứng (trong giai đoạn cứng cơ)

Kết cấu cơ thể cứng 3

Kết cấu cơ thể bắt đầu mất tê cứng 2

Kết cấu cơ thể khá mềm 1

Tiến hành thử bằng cách cắt cá giị thành từng miếng rồi quan sát. Kiểm nghiệm viên ghi nhận và cho điểm.

Kết cấu cơ thể rất mềm hoặc nhũn 0  Cách đánh giá cảm quan:

Quá trình đánh giá cảm quan phải thực hiện trong phịng “Phân tích cảm quan” đạt yêu cầu. Hội đồng đánh giá từ 5 đến 12 người đều am hiểu lĩnh vực về cá tươi. Các thành viên phải cĩ đánh giá khách quan, cĩ khả năng phân biệt cảm giác.

 Cách tính điểm trung bình:

Mỗi kiểm nghiệm viên cho một điểm nhất định, điểm được đưa và kết quả là điểm trung bình của tất cả các kiểm nghiệm viên. Nếu một chỉ tiêu nào đĩ cĩ điểm “0” thì tiến hành đánh giá lại chỉ tiêu đĩ. Nếu hội đồng thống nhất đánh giá cho một chỉ tiêu nào đĩ “0” điểm thì điểm chung bằng “0” và sản phẩm coi như hỏng. Nếu thành viên nào cho điểm lệch quá 1,5 điểm trung bình chưa cĩ trọng lượng của hội đồng thì điểm của thành viên đĩ bị loại.

2.2.3. Xác định hàm lượng protein tổng số

 Các bước tiến hành:  Vơ cơ hĩa mẫu

 Cân mẫu khoảng 0,5 g cho vào ống Kjeldahl cĩ dung tích phù hợp (thường 250 ml).

 Thêm một lượng chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4) phù hợp khoảng 0,9 đến 1,2 g.

 Thêm 20 ml H2SO4 vào ống Kjeldahl. Trộn đều, đảm bảo đã làm ướt toàn bộ phần mẫu thử. Đặt bộ ống Kjeldahl vào bộ phá mẫu.

 Cài đặt nhiệt độ và thời gian cho máy. Tổng thời gian vơ cơ hĩa từ 3 đến 4 giờ.

 Sau khi phá mẫu hoàn tất, chất lỏng trong bình trong và cĩ màu xanh da trời nhạt. Để nguội, nếu thấy quá trình vơ cơ hĩa xuất hiện cặn rắn thì cho một ít nước cất vào rồi lắc đều.

 Chưng cất ammoniac

 Đem mẫu đi chưng cất. Cài đặt thơng số cho máy (dựa theo catalogue) như sau:

o H2O: 2 giây o H3BO3: 3 giây o NaOH: 5 giây

 Thêm vài giọt chỉ thị TaShiro vào bình hấp thu và chưng cất

 Chuẩn độ

 Nhỏ 3 giọt chỉ thị hỗn hợp vào bình hấp thu, tiến hành chuẩn độ bằng HCl 0,02N, ghi nhận điểm cuối khi chuyển từ màu xanh dương sang mận chín. Đọc thể tích HCl tiêu tốn trên buret.

2.2.4. Xác định hàm lượng NH3

Xác định NH3 theo phương pháp chưng cất lơi cuốn hơi nước.  Nguyên lý:

Dùng một kiềm mạnh hơn NH3 để đẩy nĩ ra khỏi thực phẩm (nhưng khơng quá mạnh). Dùng hơi nước để lơi cuốn NH3. Định lượng NH3 bay ra bằng dung dịch H2SO4 0,1N dư để hấp thụ hết NH3 bay ra sau đĩ dùng kiềm 0,1N chuẩn để xác định lượng acid dư từ đĩ ta tính được hàm lượng nitơ NH3 hoặc hàm lượng NH3

trong thực phẩm.

Phương trình phản ứng:

2 NH4Cl + Mg(OH)2 = 2 NH3 + 2H2O + MgCl2

2 NH3 + H2SO4dư = (NH4)2SO4 H2SO4dư + NaOHchuẩn = Na2SO4 + 2H2O  Các bước tiến hành:

 Cân chính xác 1 g mẫu cho vào bình cầu chứa mẫu, thêm khoảng 30 ml nước, vài giọt chỉ thị màu phenolphthalein và cho MgO vào tới khi xảy ra phản ứng kiềm rõ rệt, đậy nắp và chưng cất.

 Hơi nước bốc lên ở bình cầu làm nguồn sinh hơi nước kéo NH3 qua ống sinh hàn rồi đọng lại rơi vào cốc hứng chứa H2SO4 0,1N dư và chỉ thị màu methyl đỏ.  Chưng cất tới khi hơi nước bốc ra khơng cịn NH3.

 Chuẩn độ lại H2SO4 0,1N dư bằng NaOH 0,1N.

2.2.5. Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật

a) Kiểm tra chỉ tiêu Vibrio

 Pha mơi trường TCBS trong nước cất theo hướng dẫn, đun sơi mơi trường trong bình tam giác ở 100oC trong lị vi sĩng cho đến khi tan hoàn tồn các thành phần mơi trường.

 Pha nước muối sinh lý, rồi đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút rồi để nguội.

 Nhúng mẫu cá vào dịch bacteriocin T8, để ngấm trong khoảng 5 đến 7 phút.  Sử dụng dịch vi khuẩn Vibrio đã được nuơi cấy bằng mơi trường TSB, trong 18 - 20 giờ, ở nhiệt độ 37oC để gây nhiễm lên mẫu cá cĩ nhúng dịch bacteriocin và mẫu cá đối chứng.

 Lấy mỗi mẫu một phần thịt cá khoảng 3 g (cả thịt lẫn da), đem băm nhỏ. Tùy vào khối lượng của từng mẫu thêm vào dung dịch nước cất với thể tích thích hợp theo tỷ lệ 1:9.

 Đồng nhất mẫu: Chuẩn bị mẫu xong, cho vào túi PE cĩ chứa mẫu và nước cất, đem đi đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian đồng nhất mỗi mẫu từ 90 đến 120 giây.

 Pha lỗng mẫu:

 Rĩt 9 ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử trùng vào các ống nghiệm.

 Hút 1 ml dịch mẫu từ các túi PE vào ống nghiệm, thu được dịch pha loãng với nồng độ 10-1, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều.

 Từ ống nghiệm 10-1, pha lỗng ra ống nghiệm cĩ nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cách hút 1ml từ ống nghiệm 10-1 cho vào 9 ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử trùng ở ống nghiệm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm cĩ nồng độ pha lỗng mẫu 10-2, tiếp tục làm tương tự, ta cĩ các ống nghiệm cĩ độ pha loãng mẫu 10-3, 10-4.

 Cấy trang:

 Thao tác trong tủ cấy vơ trùng, mơi trường vơ trùng, các dụng cụ đã sấy tiệt trùng ở 160oC/120 phút và các thao tác vi sinh làm bên cạnh ngọn lửa đèn cồn.

 Đun sơi mơi trường TCBS để hịa tan hồn tồn các thành phần rồi để nguội tới nhiệt độ khoảng 40oC. Rĩt 15 – 20 ml mơi trường vào các đĩa petri vơ trùng. Để khi thạch trong đĩa nguội hoàn tồn rồi bắt đầu cấy.

 Hút 100 µl dịch mẫu các nồng độ từ ống nghiệm cho vào các đĩa petri cĩ chứa thạch đã đánh dấu tương ứng. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.

 Dùng que cấy trang trang đều dịch mẫu ra bề mặt thạch, sau đĩ lật úp các đĩa petri lại.

 Dùng giấy báo bao gĩi kín các đĩa petri lại, đem đặt trong tủ ấm trong tư thế các đĩa petri nằm úp.

 Nuơi cấy trong 24 giờ rồi đem đọc kết quả.

 Kiểm tra lặp lại đối với các mẫu vi sinh 3 ngày và 6 ngày.

b) Kiểm tra chỉ tiêu Salmonella

 Các bước tiến hành:

 Pha mơi trường RV vào nước cất trong bình tam giác theo hướng dẫn, thêm một lượng agar vừa đủ. Đem mơi trường đi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.

 Pha nước muối sinh lý, rồi đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút rồi để nguội.

 Nhúng mẫu cá vào dịch bacteriocinT8, để ngấm trong khoảng 5 đến 7 phút.  Sử dụng dịch vi khuẩn Salmonella đã được nuơi cấy bằng mơi trường RV, trong 18 - 20 giờ, ở nhiệt độ 37oC để gây nhiễm lên mẫu cá cĩ nhúng dịch bacteriocin và mẫu cá đối chứng.